PCR实验代做，MRNA实验代测的整个操作流程详解

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一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录)

不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。

在总rna的提取过程中，注意避免mRNA的断裂;取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化(因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂)。

二、DNAse I 消化样品RNA 中的DNA

用DNase I 消化DNA

组份 加量

模板(RNA) 10ug

RNase Inhibitor 4ul

DNase I buffer 10ul

DNase I 10ul

DEPC处理H2O 至100ul

混匀，37℃ 90min

三、RNA琼脂糖凝胶电泳

1.1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制：

1) 称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml的DEPC水，放微波炉里溶化。

2) 待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀(避免产生气泡)。倒入凝胶板上凝固30min。

2.取各个RNA样品4µl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2µl混匀，加入变性胶加样孔中。

3.120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。

4.RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。

溶解曲线全部为单峰表明为特异性扩增。

一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期，其形状是一条平滑的S型曲线。

如果在荧光背景信号阶段出现很多拐点，可能的原因是体系未混匀或者存在固态杂质;

如果向下探头后又很快抬头然后又向下探头，可能原因是体系中模板量太高，建议模板稀释后再用。

如果引物二聚体存在则阴性对照会出现抬头现象，这在Real-Time PCR中很难避免;

若是阴性对照的溶解曲线出现和样品中同样的峰，说明体系配置中存在污染，则实验结果不可用。

在溶解曲线中出现双峰有三种可能：

① 引物峰，引物峰通常是两峰中的前面一个，消除的办法是降低体系中的引物量或重新设计引物;

② 在做基因表达差异时容易出现DNA被扩增峰(只在引物跨内含子时存在)，出现原因是提取RNA时存在DNA污染，可以通过电泳验证，这时要重新消化RNA样品中的DNA;

③ 扩增非特异，这时要重新摸扩增条件或重新设计并验证引物。

九、表达差异的计算方法

定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数;相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本或是目标转录本在不同时相的表达差异之间的表达差异。

2-△△CT方法是实时定量PCR实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法。

在有些情况下，并不需要对转录本进行定量，只需要给出相对基因表达差异即可。显然，我们说X基因在经过某种处理后表达量增加2.5倍比说该基因的表达从1000 拷贝/细胞增加到2500拷贝/细胞更加直观。

2-△△CT方法的推导(详见实时定量PCR和2-△△CT法分析基因相对表达量)

补充：在DNase I 消化样品RNA 中的DNA后，需要对样品重新进行氯仿抽提，具体实验流程如下：

消化后总体积10Oul，体积太少，不利于抽提，我们往往补加200ulDEPC水。

1. 向离心管中加入等体积氯仿(约300ul) ，剧烈颠倒，充分混匀至中层出现白色片状沉淀。4℃14000 rpm离心8min，取上清(约250ul)。

2. 加入1/10体积的NaAC(3M)(约25ul)和预冷的等体积异丙醇(约280ul)，-20℃放置20min。

3. 4℃14000 rpm离心15min，去上清，注意不要触到沉淀。

4. 加入1ml的75%乙醇，4℃14000rpm离心3min，去上清。

5. 瞬时离心，用200ul(或10ul)的枪头小心吸去离心管底的残存液态(勿吸到管底的沉淀)。

6. 把离心管放置于超净台晾至约5-10 分钟(勿*干燥，否则很难溶)。加入30~50μl的无RNase的水，静止1min 后，振荡30sec，瞬时离心。

7. 将提取的RNA立即进行下游实验，或放-20℃保存。

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