免疫组化实验中如何降低非特异性荧光染色和避免阴性着色?

免疫组化实验中如何降低非特异性荧光染色和避免阴性着色?

1、非特异性染色产生原因及其解决方案：

(1)游离荧光素残留在二抗中。一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。二抗配置时用透析法或层析法分离荧光素标记的二抗和游离的二抗。购买高质量、高纯度的荧光素二抗。

(2)抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。

(3)组织抗原封闭不全。除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原(如Forssman氏抗原)，可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。延长血清封闭时间。

(4)从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。

(5)抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。

(6)荧光素不纯、标本固定不当等。

(7)一抗和二抗孵育条件和浓度不合适。调整一抗和二抗孵育条件和浓度至。

(8)一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次数和延长清洗时间。

2、阴性染色产生的原因有：

(1)一抗和二抗浓度不合适或孵育条件不妥。

(2)荧光素提前衰退。荧光素质量不佳或操作过程中没有注意避光等防止荧光素衰退的事项。

(3)血清封闭时间过长。

(4)抗体稀释液PH值不合适，影响抗原抗体反应。

(5)组织切片不平、裂片或脱片很严重，易引起大块阴性着色。

(6)组织标本不新鲜或已经冷冻组织制成的切片中抗原易弥散，易引起本来表达的部位阴性染色或弱着色。

(7)荧光显微镜不会使用，激发波长选择错误。

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