常用elisa试剂盒操作要点

   elisa试剂盒操作步骤包括样本的采集和保存、试剂和样本的平衡、加样、温育、洗涤、显色、比色、结果判定和结果报告。环节众多，任一环节操作不当，皆可影响测定结果。因此，必须重视各环节操作，掌握控制要点，方能保证检测结果准确可靠。

1  样本的采集和保存  

 作为激素和治疗药物测定的样本应考虑采集时间及体位等因素影响,可的松和促激素清晨会有一峰值出现；生长激素、促黄体激素、促卵泡激素均以阵发性方式排放；从卧位变为站位时，肾素活性将明显增高；药物浓度监测应根据药代动力学选择合适时间采集样本。

外源性干扰因素对检测结果的影响，溶血、脂血、细菌污染、血液标本收缩不充分、存贮过久、反复融冻等。尽量使用玻璃试管抽血，慎用塑料试管盛血，因聚乙烯易吸附抗原和抗体，影响检测结果。

2日内测定血液样本，，置2℃—8℃冰箱保存；2日至7日内测定，置2℃—8℃冰箱保存；7日以上测定，置-20℃以下冰箱保存。

2  试剂和样本的平衡   

试剂和样本在测定前应先放置室温（20℃—25℃）平衡20分钟以上，以保证后续操作步骤中抗原抗体足够反应温度。

3  加样本及试剂   

应正确使用移液器和试剂滴瓶。移液器应定期校准和维护，加样本时，应加在微孔下1/3处，不可擦划底部、冲起泡、加到微孔上缘或溅出。滴加试剂（包括抗原、酶结合物及显色剂）时，应摇匀试剂，先弃去瓶口1—2滴，然后垂直、均匀加入微孔。

4  温育  

 温育是ELISA操作中的关键步骤。国产试剂通常采用37℃30分钟和37℃60分钟两种方式。为保证温度均一，抗原抗体反应充分，宜采用水浴方式加热。如用孵箱，可内置一方盘，底衬纱布，加入适量水，微孔板放入其中温育。

5  洗涤  

 ELISA为异相固态方式检测，所以分离结合和游离酶结合物是一个重要环节，洗涤即是达到这样一个目的。洗板质量直接影响检测结果，所以需重视洗板质量。现在新推出的洗板机大多增设有两点吸液、底部冲洗和振荡等功能，可以充分保证洗板质量。手工洗板时，应严格按照试剂说明书操作，洗涤不足和洗涤过度都将影响检测结果。

6  显色  

 ELISA显色常用TMB和H2O2作为显色剂，显色时间37℃15—20分钟，显色过程可不避光。使用前应检查显色剂是否变质，严格控制显色时间。显色剂质量检查，在玻片、试管或eppendorf管中滴入显色剂A和B各一滴，若不变色，则质量可靠。继续滴入一滴酶结合物，摇匀后几分钟内溶液出现蓝色，既可检查显色剂质量，又可检查酶结合物质量。

7  比色   

加终止液终止显色反应后，通常要求30分钟内用酶标仪完成比色测定。采用主波长450nm测定，可有效避免微孔上的划痕、指印及其它附着物对光的干扰。另外，加终止液后，应尽快比色，因为呈色深的微孔易出现沉淀致吸光度下降明显。

8        结果判断和结果报告   

判断结果时，要正确按照试剂盒要求设置计算参数，内外对照值均应在控，才能判定测定结果有效。对于少见模式和临界值附近结果应坚持复核