信帆分享：实验达人做Western-blot成功的秘诀

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1. 提取，组织一定要切成小块，可以用剪刀剪或刀切，剪碎后再提取，蛋白浓度能高出一倍来。

2. 研磨一定要在冰上进行，一般间断研磨30分钟就足够了。

3. 离心，一般30分钟。

4. 电泳，网上有人说胶要提前一天灌好，放一夜再用（有人说放冰箱里，有人说室温），结果发现室温放置后第二天上样孔处就干了，变形不好上样；zui关键的是，我发现，当天新灌的胶走出来的条带清楚，而提前一天做的则走出来条带模糊；所以建议大家还是当天做胶比较好。我一般是到实验室后，把制冰机打开，大冰冻离心机打开，然后开始做胶，把分离胶灌好以后，开始提取蛋白，1小时左右开始离心了，再灌浓缩胶；这样胶大约有一个小时的凝固时间，足够了。 要注意的是，灌完分离胶加水的时候，要贴玻璃板的一个角加水，否则胶的局部会受到影响，影响电泳条带笔直度。

5. 电泳缓冲液可以重复用； 做胶的试剂买分析纯的一般试剂使用一点问题都没有，不用买进口的很贵的所谓试剂； 我的蛋白分子量分别是40 和170，我分离胶用10%，浓缩用4%，一点问题都没有，都走的很好，分的很开。

6. 转膜，我一般电湿转，80 V 电压转2小时，即使分子量170 kDa 的蛋白也能转得过去，不用过夜的转法，节省时间；我的40 kDa 和170 kDa 蛋白一起转，没有问题。

7. 封闭，我用5%奶粉，的，室温下摇晃封闭1小时，太长了没必要，更不一定需要过一夜。

8. 一抗，我用的是Santa的一抗，1：400稀释（10 ul/4 ml 牛奶），用杂交袋摇晃杂交1小时，没必要过夜；用杂交袋很省抗体；抗体不重复用；但是我当天重复用两次，效果也还可以；杂交的时候要保持蛋白面超上。

9. 洗一抗，我是室温下洗10 X 3次。

10. 二抗，我用1:2000，室温杂交50分钟，也是用杂交袋，6 ml 左右，我的膜比。

11. 再洗二抗，同前。

12. 显色，我是把膜蛋白面朝上放在培养皿上，然后往上面滴显色AB液，反应2-3分钟，然后不擦干直接放暗盒里，上面盖层保鲜膜，用笔画出膜的边缘，以免暗室内找不到膜的位置。

13. 洗片，我用培养皿装显影剂，节省啊，然后捞出后用水冲一下，再放进定影液里。

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