如何正确使用明胶酶谱分析试剂盒

如何正确使用明胶酶谱分析试剂盒

如果您对基质金属蛋白酶MMP2/MMP9明胶酶谱检测分析试剂盒感兴趣，欢迎信帆生物科技有限公司了解！

明胶酶谱分析试剂盒使用注意事项：

1.制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡。

2.明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子，和PH值等因素的影响，因此缓冲液配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。

3.用大梳子

4.孵育液的PH在7.5-7.6，复性的TRITON时间长了会有絮状物，所以实验时尽量使用新鲜配置的。

5.孵育的37度不要在CO2培养箱中，因为会改变孵育液的PH值，在普通孵箱即可。

明胶酶谱分析试剂盒检测步骤：

1 制备含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝胶：分离胶浓度为8%。按照标准程序制备SDS PAGE凝胶。将10 × substrate G 融化，并90 ºC 加热5分钟。分别在浓缩胶和分离胶中额外加入10 × substrate G 并使之稀释10倍，混匀后加入过硫酸铵和TEMED，等待凝胶聚合。

2 待测样品1:1 稀释于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上样。切勿加热变性，并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量，使用普通蛋白预染Marker 即可。阳性对照(可选步骤)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血与100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等体积混合，取5-15μl 上样。

3 低电流恒流电泳，每一块小胶电流为20 mA/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。

4 洗涤凝胶：取出凝胶，去除浓缩胶，放入容器内。可先用适量蒸馏水冲洗凝胶，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸馏水稀释)，室温漂洗凝胶2 × 30 分钟。中间换液。

5 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸馏水稀释)，室温或37ºC 孵育1~5 小时。阳性对照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小时即可显示。如MMP 活性低，应延长孵育时间为10小时或过夜。

6 显色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液（操作步骤见后面所附SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书）。凝胶的大部分区域被深染，在有MMP 条带的位置不被染色而形成透亮区域。透明区域的位置和范围指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及活性。阳性对照将在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出现透明条带。

7 条带扫描：将凝胶放在扫描仪上扫描。虽然MMP条带透明，但凝胶背景并非真正全黑。解决办法：可用非透射光扫描，或用软件图像处理程序调整背景显示为灰度显示，并尽量设置为黑色。MMP 条带则为白色，这种背景黑条带白的格式是英文论文中zui常见的格式。

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使用信帆生物明胶酶谱法试剂盒发表的文章：

《绿茶多酚EGCG增强动脉粥样硬化斑块稳定性及其相关机制研究》

*部分绿茶多酚EGCG增强高脂饮食喂养ApoE缺陷小鼠动脉粥样硬化斑块稳定性目的:急性冠脉综合征(Acute coronary syndrome,ACS)是指一系列严重的急性心肌缺血性疾病,主要包括不稳定型心绞痛以及急性ST段抬高或非ST段抬高型心肌梗死。目前大量研究资料已证实,急性冠脉综合征发病的zui主要病理生理基础是冠状动脉中不稳定型动脉粥样硬化斑块的破裂,引起冠状动脉内急性血栓形成,继而引起心肌严重的缺血、缺氧。近年来,多项流行病学研究报道称,饮用绿茶可以明显降低冠心病的发病率。绿茶的抗动脉粥样硬化作用主要原因是绿茶中含有大量的多酚类化合物,其中含量zui多的为儿茶素。绿茶中儿茶素主要成分包括表儿茶素(EC),表儿茶素没食子酸酯(ECG),表没食子儿茶素(EGC)和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)。在这些成分中,以EGCG含量zui丰富,活性zui强,已被证明具有多种药理学作用和生物学特性。我们进行本研究主要目的就是为了证实绿茶多酚EGCG是否能够增强高脂饮食喂养ApoE缺陷小鼠动脉粥样硬化斑块稳定性并探讨其可能的相关机制。

方法:30只雄性ApoE缺陷小鼠(6周龄,体重18-20g)被随机分为对照组(n=15)以及EGCG组(n=15)这些小鼠均使用含有21%脂肪以及0.15%胆固醇的高脂饮食喂养。EGCG组以及对照组分别给予EGCG(10mg/kg)或者同等剂量的0.9%生理盐水进行腹腔注射共16周。随后麻醉处死小鼠,取小鼠头臂干动脉并予固定石蜡包埋。小鼠头臂干横切面进行HE染色以及Masson染色分别评估动脉粥样硬化斑块形态以及胶原含量。此外,使用免疫组织化学染色的方法分析小鼠斑块中巨噬细胞以及平滑肌细胞成分的比例。蛋白质印迹法(Western blot)用来检测斑块中蛋白表达水平,明胶酶谱法用来检测斑块中基质金属蛋白酶的活性。

MMP明胶酶谱试剂盒的正确使用方法-信帆生物

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