RNA的提取原理及方法

细胞中的 RNA 可以分为信使 RNA、转运 RNA 和核糖体 RNA 三大类，不同组织总 RNA 提取的实质就是将细胞裂解，释放出 RNA，并通过不同方式去除蛋白，DNA 等杂质，终获得高纯度 RNA 产物的过程。

RNA 提取流程

1.样品处理

从各种不同来源样品（如细菌、酵母、血液、动物组织、植物组织和培养细胞）,或同一来源样品的不同组织（如植物幼嫩叶片、成熟根、茎等）中提取高质量的 RNA，因细胞结构及所含的成分不同，样品预处理的方式也各有差异。

样品的要求

使用新鲜的样品或取样后立即在低温（-20℃或-70℃）冷冻保存的样品，避免反复冻融，因为这会导致提取的 RNA 降解和提取量下降。

样品预处理方式

植物材料-液氮研磨

动物材料-匀浆、液氮研磨

细菌-溶菌酶破壁

酵母-液氮研磨、玻璃珠处理、混合酶破壁

2.细胞裂解

异硫氰酸胍/苯酚法（TRIZOL）

这是一种传统的 RNA 提取方法，适用于大部分动植物材料，但对于次生代谢产物较多的植物材料提取 RNA 效果较差。异硫氰酸胍能使核蛋白复合体解离，并将 RNA 释放到溶液中，采用酸性酚-氯fang混合液抽提，低 PH 值的酚将使 RNA 进入水相，而蛋白质和 DNA 仍留在有机相，从而可以完成 RNA 的提取工作。

该法应用非常广泛，适用于包括动物组织、微生物、培养细胞等在内的各类动物性材料，同时还适用于次生代谢物较少的植物性材料，如幼苗、幼叶等。该法主要应用在动物组织和培养细胞的 RNA 提取中。

胍盐/β-巯基乙醇法

适用于各种不同动物材料和次生代谢物少的植物材料。

在这种方法中，胍盐使细胞充分裂解，β-巯基乙醇作为蛋白的变性剂在实验全程中可以抑制 RNaseA 的活性，保护 RNA 不被降解。有些植物材料多糖多酚含量较高，如植物果实，番茄的叶子等，有些植物木质化程度较高，如根茎等组织。针对这类材料本公司推出了一种全新的植物总 RNA 提取试剂，该试剂特别适合于从富含多糖、多酚、淀粉的材料中提取纯度高、完整性好的总 RNA，有关的具体步骤将在分论中详细介绍，实验者可根据自己的需要进行选择。

3.RNA 纯化及获得

纯化要求

RNA 样品中不应存在对酶（如逆转录酶）有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。避免其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染。排除 DNA 分子的污染。

纯化方法及沉淀

方法一：有机溶剂抽提法

氯fang抽提

在使用 RNA 提取试剂进行 RNA 提取时，常使用氯fang进行抽提，以去除蔗糖、蛋白等杂质，并促进水相与有机相的分离，从而达到纯化RNA 的方法。

沉淀

氯fang抽提 RNA 后，一般采用了异丙醇或乙醇来沉淀水相 RNA。加入 0.6 倍水相体积的异丙醇或与水相等体积的异丙醇，室温沉淀 20-30 分钟，高速离心，可获得 RNA 沉淀。

洗涤沉淀

加入无 RNase 的 75%乙醇，将 RNA 沉淀振荡悬浮，使 RNA 沉淀中的盐离子被充分溶解。然后再离心 10-30 分钟。再次沉淀 RNA。离心后，小心倒掉上清（注意不要倒出 RNA 沉淀），随后快速离心 1-2 秒，将残留在管壁上的乙醇试剂到管底后，用小枪头吸净，超静台中风干 1-2 分钟（注意不要晾得太干，否则 RNA 沉淀不易溶解）。

溶解沉淀

加入适量 RNase-free ddH2O 溶解 RNA 沉淀。

方法二：硅基质吸附法

随着实验方法的改进，现已发展出一种采用吸附材料纯化核酸的方法。目前较常见的有：硅基质吸附材料、阴离子交换树脂和磁珠等。硅基质吸附材料具有可特异吸附核酸，使用方便、快捷、不使用有毒溶剂如苯酚、氯fang等优点。

一些特殊组织的 RNA 提取

纤维组织

心脏/骨骼肌等纤维组织提取 RNA 的关键在于*破碎组织。这些组织细胞密度低，单位重量的组织中 RNA 含量较低，建议增加起始量。

此外，一定要在液氮中将组织*磨碎。

蛋白/脂肪含量较高的组织

脑或植物脂肪含量高，酚/氯fang抽提后，上清含白色絮状物。必须用氯fang再次对上清进行抽提。

核酸/RNase 含量高的组织

脾、胸腺等组织的核酸和 RNase 含量很高，在液氮中研磨，再快速匀浆，能有效灭活 RNase。如加入裂解液后变得粘稠，酚/氯fang抽提不能有效分层，则加入更多裂解液可以解决此问题。多次酚/氯fang抽提可以去除更多残留的 DNA。如果加入乙醇后马上有白色沉淀形成，表明可能有 DNA 污染，可以在核酸溶解后用酸性酚/氯fang再次抽提或者用 Dnase1 消化，去除 DNA 污染。

植物组织和真菌组织

植物组织和真菌组织比动物组织更为复杂，一般选择在液氮条件下对样品进行研磨，以避免内源 RNase 降解 RNA。如果 RNA 降解问题不能解决，大多数情况下是样品中含有的杂质所致。许多植物和真菌中的内含杂质和多糖、多酚等都会残留，因为这些杂质分子与 RNA 有一些相似性，可与 RNA 同时沉淀或者吸附，因此在植物和真菌组织的提取中，需要用一些特别的步骤或者特别的试剂来去除多糖多酚等杂质的干扰和污染。

RNA 评价与鉴定

提取得到 RNA 溶液后，我们需要对 RNA 进行相关的质量检测，以确定它是否符合后续实验的要求。RNA 用于不同的后续实验，对其质量要求不尽相同。cDNA 文库构建要求 RNA 完整且无酶等抑制物残留；Northern blot 实验对 RNA 完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低；RT-PCR 实验对RNA 完整性要求不太高，但对酶反应抑制物残留要求严格。因此在进行不同的实验时应选择不同的方法纯化RNA，以达到jia的实验效果。

RNA 得率检测—分光光度计法

RNA 得率有很强的组织特异性，不同组织 RNA 的丰度和 RNA 提取的易难程度共同决定了该种组织的 RNA 得率。一般来说，可通过分光光度计测定 RNA 溶液在 260nm 处的吸光值来计算 RNA 的含量。RNA 溶液在 260、320、230、280nm下的吸光度分别代表了核酸、溶液浑浊度、杂质浓度和蛋白等有机物的吸收值。用标准样品测得在波长260nm 处，1ug/mlRNA 钠吸光度0.025（光程为1cm），即OD260=1时，样品中 RNA 浓度为 40ug/ml。通常分光光度计 OD260 的读数要介于 0.15-1.0 之间才是可靠的。因此 RNA 提取结束后，要根据大概产量稀释到适当浓度范围，再用分光光度计检测。

按下面的共识计算总 RNA 浓度：

• RNA 浓度（ug/ml）=OD260×稀释倍数×40ug/ml

RNA 纯度检测---分光光度计法

通过 OD260/280 来检测 RNA 纯度，OD260/230 作为参考值。

OD260/280 在 1.9-2.1 之间，可以认为 RNA 的纯度较好；

OD260/280 值小于 1.8，则表明蛋白杂质较多；

OD260/280 值大于 2.2，则表明 RNA 已经降解；

OD260/230 值小于 2.0，则表明裂解液中有异硫氰酸胍和β-巯基乙醇法残留。

注意：如果用 TE 溶解或洗脱 RNA，会使 OD260/280 值偏大。