实时荧光定量PCR检测服务-信帆生物

实时荧光定量PCR检测服务-信帆生物

信帆生物提供RT-PCR实验代测服务，检测周期短，实验操作人员技术成熟，误差小，结果真实确认可靠。

一、服务介绍

实时PCR（real-time PCR），属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。定量方式包括定量和相对定量。可检测mRNA，microRNA，lncRNA和DNA水平的基因拷贝数变化。

二、服务流程

1、引物设计与合成

2、DNA/RNA抽提

3、反转录（针对RNA）

4、上机定量分析

三、客户提供

1、全血、组织或细胞。细胞：细胞数>10⁷，组织：总量>200mg，DNA或RNA样品：总量>5ug

2、引物，或由信帆生物提供。

3、基因信息：目的基因名称、物种和序列（或GenBank Accession Number）。

四、交付内容

实验报告：详细操作步骤

原始数据：扩增曲线图，ct值

　　实时荧光定量PCR检测服务所使用的荧光化学材料可分为两大类,即荧光染料和荧光探针。荧光染料以SYBR GreenⅠ为主要代表,是非特异性荧光化学材料。荧光探针包括TaqMan、分子信标、荧光标记引物、杂交探针等,属于特异性荧光材料。

　　SYBR GreenⅠ是一种能够与双链DNA小沟结合的染料。在游离状态下,SYBR GreenⅠ发出微弱的荧光,但是一旦与双链DNA结合,其荧光强度大大增强。因此,一个反应发出的全部荧光信号与出现的双链DNA量成正比,可以根据荧光信号检测出PCR体系中的双链DNA的数量。其优点是检测方法简单,通用性好,价格相对较低,是许多实验室开展荧光定量实验。SYBR GreenⅠ的缺点在于它能够和所有的双链DNA相结合,因此由引物二聚体、单链二级结构、非特异性扩增产物引起的荧光信号会影响定量的准确性。但可以通过优化PCR的反应条件、选择设计良好的引物,来减少或去除引物二聚体和非特异性产物的产生;另外,也可以通过对扩增产物的溶解曲线进行分析来判断荧光信号的真实性。

　　TaqMan探针技术是有美国Perkin Elmer(PE)公司研制的一种实时PCR定量技术,在PCR扩增加入一对引物的同时加入1个特异性的荧光探针,此荧光探针为一个30~45 bp的寡核苷酸,它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对,其5′端标记荧光发射基团,3′端标记荧光淬灭基团。当探针保持完整时,3′端淬灭基团抑制了5′端发射基团的荧光发射。但在PCR扩增中,模板变性后低温退火,引物与探针同时与模板结合,在引物的介导下,沿模板向前延伸至探针结合处,发生链的置换,Taq DNA聚合酶的5′→3′外切酶活性将探针5′端连接的荧光发射基团从探针上切割下来,游离于反应体系中,从而脱离3'端荧光淬灭基团的屏蔽,接受光刺激发出荧光信号。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是相对应关系,且荧光强度同被释放的荧光基团的数目也是正比关系,因此该技术可对模板进行准确定量。TaqMan探针技术特异性好、准确性高、假阳性低、重复性比较好。但是需要设计特异性的探针,因此成本较高。

　　分子信标技术是一种呈发夹结构的茎环状双标记寡核苷酸探针,环部与靶DNA序列互补,为15~35 bp;茎部是由互相配对的碱基组成,但与靶DNA无序列同源性,约8 bp。在探针的5′端和3′端分别标记荧光发射基团和荧光淬灭基团。当溶液中的模板与分子信标结合配对时,分子信标的构象改变成链状使得荧光发射基团与淬灭基团分开,当荧光基团被激发时,就发出荧光信号。与探针互补的靶分子数量越多,荧光信号也就越强,从而实现了对目的基因的定量检测。分子信标的方法优点是特异性强,荧光背景低。其缺点是设计困难,杂交探针不能*与模板结合,稳定性较差,价格高。

【仪器设备】 
PCR扩增仪 
电泳装置 
微量离心机 
微量移液器（1～20ml和20～200ml） 
0.5ml Eppendorf 管 
紫外线观察装置及照相设备
2.2.2.3 操作程序 
1．在无菌的Eppendorf管内加入以下反应物：

2．93℃ 反应2 min后开始以下循环： 
93℃变性反应1 min； 
50℃退火反应1 min； 
72℃延伸反应3 min。 
经过17～35循环后，zui后一个循环72℃增加5 min。循环结束后反应产物置于40℃保存。 
3．取1～5ml反应产物走凝胶电泳，经溴化乙锭染色检测扩增的情况。

2.2.2.4 应注意的问题及其解决方法 
1．PCR反应条件的优化 
要优化特定的PCR反应，有必要试用不同的反应组分和循环参数。表2-1列出了添加或改变某一试剂浓度对反应结果的影响，从中大家可以得到一些线索以改进反应条件，提高PCR产量和/或特异性，一般情况下，只须改变一两个参数就行了，如pH值和MgCl₂浓度。表2-2给出了循环参数对PCR结果的影响。 
表2-1 PCR各反应组分浓度对产物特异性和产量的影响

* 效果可能不可预测
** 添加10% DMSO时，Taq DNA聚合酶的活性会被抑制47%，因此反应加大Taq DNA聚合酶的用量（即5U）予以补偿
*** Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut
表2-2 可改变以提高PCR产物的特异性和/或产量的循环参数

* 使用基因组DNA作模板时，开始几个循环变性应于97℃进行 
** 假定Tm值为60℃ 
*** 延伸时间依产物大小而定：1000bp的产物延伸30s即可，产物更长时，按每1000 bp延伸0.5 min计，在后期循环中增加延伸时间可以提高扩增效率
2．引物的设计 
毫无疑问，引物的碱基组成，长度及其靶序列的同源性是决定PCR成败的首要因素，选择设计引物在一定程度上仍然要靠经验，对于某一对引物而言尚无通用的规则可严，但应遵守以下原则： 
（1）一般性原则： 
①长度：15～30bp，其有效长度 [Ln=2 (G+C)+(A+T)] 一般不大于38，否则PCR的zui适延伸温度会超过Taq酶的*作用温度（74℃），从而降低产物的特异性。 
②G＋C含量：应在45%～55%之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5～10度。引物长度小于20时，其Tm值等于4×(G+C)+2×(A+T)。 
③ 碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现3个的连续的G或C，否则会使引物在G＋C富集序列区错误引发。 
④ 引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。 
⑤引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。 
⑥特异性：与非特异扩增序列的同源性应小于70%，或少于连续8个的互补碱基。 

提供RT-PCR实验检测，实时荧光定量PCR实验检测服务

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