微生物实验室技术

微生物实验室技术

一、

器皿的包扎

为了使灭菌后仍保持无菌状态，各种玻璃器皿均需包扎。

1、培养皿：洗涤烘干后的培养皿每5~8套作为一包，用牢固的纸卷成一筒，外面用绳子捆扎，以免散开，然后进行灭菌。至使用时才能在无菌室中打开取出。

2、吸管：洗净烘干后的吸管，在吸管的粗头顶端用尖头镊子或针塞入少许脱脂棉花，约1.5cm长，以防止菌体误吸入口中的微生物吹入吸管而进入培养物中造成污染。塞入棉花的量要适宜，棉花不宜露在吸管外面，多余的棉花可用酒精灯的火焰把它烧掉。每根吸管用一条宽约4~5cm的纸条，以45°左右的角度螺旋形卷起来。吸管的尖-端在头部，吸管的另一端用剩余的纸条折叠打结以免散开，标上容量。灭菌后，要在使用时才从吸管中间拧断纸条抽取吸管，或用双层白棉布做成长度适宜的袋子，若干支吸管装成一袋，吸管的尖-端在布袋的封口处，吸口在袋口处，装好后将袋口扎紧，灭菌。

注意，布袋装吸管时不宜用于热灭菌法灭菌。

3、试管和三角烧瓶：试管要用合适的棉花塞，棉花塞起过滤作用，避免空气中的微生物进入试管。要求使棉花塞紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙，不能过紧也不能过松。过紧易挤破管口，过松易掉落和污染。棉花塞的长度不小于直径的二倍，约2/3塞进管中。

若干支试管用绳扎在一起，在棉花塞部分用牛皮纸包裹，在纸外用绳扎紧后灭菌。每个三角瓶用双层牛皮纸将瓶口包裹然后用棉绳扎紧。

二、

玻璃器皿的洗涤

微生物学实验中，常有的玻璃器皿、三角烧瓶、试管、吸管等洗涤是否干净，灭菌是否*，对实验结果的正确性有直接的影响。洗涤后的器皿应达到玻璃壁能被水均匀润湿而无条纹和水珠。

1、新玻璃器皿的洗涤：新玻璃器皿常略带碱性，使用前应先用1~2%HCl水溶液（体积分数）浸泡数小时或过夜，再用洗衣粉或洗洁精洗涤，然后用清水洗净，必要时再用蒸馏水冲洗，倒立于晾干架上或烘干。

2、一般玻璃器皿的洗涤：一般器皿用完后，立即用洗洁精浸泡，用毛刷刷洗，并用清水冲净。如粘污有细菌培养物的器皿应进行高压灭菌后再刷洗。灭菌前不要随意堆放。

3、难洗器皿的洗涤：难洗的器皿不要与易洗涤的器皿混在一起。有油的器皿不要与无油的器皿混在一起，否则使本来无油的器皿也粘上油污，浪费洗涤剂和时间。

三、无菌操作的基本原则

1、无菌室应当经常打扫，用来苏水擦洗桌面、台面及墙壁。无菌室在使用前，用紫外线灯照射30min进行空气消毒。

2、进入无菌室前先洗手，在缓冲间内换上干净并经紫外线灯照射过的工作衣、工作帽、口-罩及工作鞋。工作鞋只准在无菌室内使用，不准穿到其它地方去。

3、样品及无菌物打开后，操作者在操作时应于样品及无菌物保持一定的距离；未经消毒的手及物品不可直接接触样品及无菌样品；样品及无菌物不可在空气中暴露过久，操作要正确、迅速；取样时必须用无菌钳或无菌镊子，手臂不可从样品及无菌物面上横过；从无菌容器中或样品中取出的物品即使未被污染，也不能放回原处。

4、无菌物品应分类放置于固定地点，并定期检查，不可与未灭菌的物品混放在一起。

5、不能在无菌室内谈笑，尽量少走动。

6、无菌室应定期熏蒸消毒。

第四节   常用微生物检验仪器及器皿

一、电热恒温水浴锅

1、构造：水浴箱分内外两层，内层用铝板制成，槽底安装铜管，内装电阻丝，用瓷接线柱连通两股导线至控制器。控制器由热开关及电路组成，外壳用薄钢板制成。表面烤漆覆盖，内壁用隔热材料制成。控制器的全部电器部件均装在电器箱内。控制器表面有电源开关、调温按钮和指示灯。在水箱左下侧有放水阀门，在水箱后上侧可插温度计。

2、使用方法

①关闭放水阀门，将水浴箱内注入清水至适当深度。

②安装地线，接通电源线。

③顺时针调节调温旋钮到适当位置。

④开启电源，红灯亮显示电阻丝通电加热。

⑤电阻丝加热后温度计的指数上升到离预定温度约2℃时，应反向转动调温旋钮至红灯熄灭，此后红灯不断熄亮，表示温控在起作用，这时再略微调节调温旋钮即可达到预定温度。

3、注意事项

①水位要保持不低于电热管，否则会立即烧坏电热管。

②控制箱内部不可受潮湿，以防漏电。

③使用时注意水箱是否有渗漏现象。

二、培养箱

培养箱亦称保温箱，是培养微生物的主要仪器。

1、构造：培养箱是一般为方形或长方形，以铁皮喷漆制成外壳，铅板作内壁，夹层充以石棉或玻璃棉等绝缘材料以防温度扩散。内层底下安装电阻丝用以加热，利用空气对流，使箱内温度均匀。箱内设有金属孔架数层，用以搁置培养材料。箱门双重，内设玻璃门，便于观看箱内标本，外为金属门。每次取放培养物时，均应尽快进行，以免影响恒温。箱顶装有一支温度计，可以测知箱内温度。箱壁装有温度调节器可以调节温度。根据使用需要，检验室可常设37℃、44℃、28℃恒温箱各一个。

2、操作方法与维护

①先开箱门，接通电源，加热到所需温度，待用。

②箱内不应放入过热或过冷之物，取放物品时，应随手关闭箱门，以维持恒温。

③箱内可放入装水容器一只，以维持箱内湿度和减少培养物中的水分大量蒸发。

④培养箱zui底层温度较高，培养物不应直接与之接触。箱内培养物不应放置过挤，以保证培养和受温均匀。各层金属孔上放置物品不应过重，以免将金属孔架压弯滑脱，打碎培养标本。

⑤可每月进行箱内消毒一次。方法为断电后，先用3%（体积分数）的来苏水溶液涂布消毒，再用清水抹布擦净。

⑥培养用恒温箱，不准作烘干衣帽等其它用途。

三、超净工作台

超净工作台是一种局部层流（平行流）装置，它能在局部造成高洁净度的环境。超净工作台的操作方法与注意事项如下：

1、超净工作台用三相四线380v电源，通电后检查风机转向是否正确，风机转向不对，则风速很小，将电源输入线调整即可。

2、使用前30min打开紫外线杀菌灯，对工作区域进行照射，把细菌病毒全部杀死。

3、使用*min将通风机启动。台面用海绵或白纱布擦干净。

4、操作时把开关按钮拨在照明处，操作室杀菌灯即熄灭。

5、操作区为层流区，因此物品的放置不应妨碍气流的正常流动，工作人员应尽量避免能引起扰乱气流的动作，以免造成人身污染。

6、操作者应穿着洁净工作服、工作鞋、戴好口-罩。

7、工作完毕后停止风机运行，把防尘帘放下。

8、使用过程如发现问题应立即切断电源，报修理人员检查维修。

9、超净工作台安装的地方应远离有振动及噪声大的地方，以防止振动对它的影响，若周围有振动，应采取措施。

10、每3~6个月用仪器检查超净工作台性能有无变化，测试整机风速时，采用热球式风速仪（QDF—2型）。如操作区风速低于0.2m/s，应对初、中、高三级过滤器逐级做清洗除尘处理。一般连续使用6个月后，定期将泡沫塑料进行清洗，用10%纯碱溶液（质量分数）浸泡8小时后，用清水漂洗干净。测试振动时采用CZI晶体管测振仪。

11、搬运时必须十分小心，防止碰击，并注意将通风机底座托起，以免损伤。

四、显微镜

1、光学显微镜的构造：显微镜的基本构造包括光学部分和机械部分。

①光学部分

A、目镜：装在镜筒上端，其上刻有放大倍数，常用的有5倍（5×）、10倍（10×）及15倍（15×）。为了指示物像，境中可自装黑色细丝一条，通常使用一段头发作为指针。

B、物镜：显微镜zui主要的光学装置位于镜筒下端。普通光学显微镜一般装有三个物镜，分别为低倍镜(4~10倍)、高倍镜(40~45倍)和油镜倍镜(90~100倍)。各物镜的放大倍数也可由外形辨认，镜头长度越长，放大倍数越大；反之，放大倍数越小。

C、集光器：位于载物台下方，可上下移动，起调节和集中光线的作用。

D、反光镜：装在显微镜下方，有平凹两面，可自由转动方向，以便将*光线反射至集光器。

②机械部分

A、镜座：是用来支持显微镜，呈马蹄形，在显微镜的底部。

B、镜臂：在镜座上面和镜筒后面，呈圆弧形，为显微镜移动时的握持部分。

C、镜筒：在显微镜的前方上部，是一个金属制空心圆筒，光线可从此通过。圆筒的上端可插入接目镜。

D、旋转器：在镜筒下端与螺纹口相接，有3~4个孔，用于装备不同放大倍数接物镜。

E、载物台：在镜筒下方，呈圆形或方形，中间有孔可透过光线。台上有用来固定标本的弹簧夹，弹簧夹连接推进器，捻动其上的螺旋，能使标本前后左右移动。

F、升降调节器：在镜筒后方两侧，分粗、细调节两组，用来调节镜筒高低位置，使物镜聚焦准确。

G、倾斜开关：介于镜臂和镜座之间，为镜筒作前后变化时的支撑点。

H、光圈：在集光器下方，可以任意开闭，用来调节射入集光器的光线。

I、次台：位于载物台下，次台上安有集光器、光圈。

2、光学显微镜的工作原理：普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像。一般微生物学使用的显微镜有三个物镜，其中油镜对微生物学研究zui为重要。油镜的分辨力可达到0.2µm左右。大部分细菌的直径在0.5µm以上，所以油镜更能看清细菌的个体形态。

3、暗视野显微镜的原理：暗视野显微镜的名称源于它使用一种特殊的暗视野聚光器。在此聚光器中央有一光档。使光线仅由边缘进入并汇聚于载玻片上，斜照物体，使物体表面的反射光进入物镜。所以我们在黑暗的背景中看到的只是物体受光的侧面，是它边缘发亮的轮廓。

使用暗视野显微镜的时候，只需将光学显微镜上的聚光器取下，换上暗视野聚光器即可。暗视野显微镜的分辨力比普通光学显微镜大。暗视野显微镜的适于观察视野中由于反差过小不易观察而折射率很强的物体，以及观察一些小于显微镜分辨极限的微小颗粒或鞭毛等。故常用于观察未染色活菌的运动和鞭毛。

4、显微镜的使用

1）观察前的准备

显微镜的使用应按以下顺序进行：安置→调光源→调目镜→调聚光器→低倍镜→高倍镜→油镜→擦镜→复原

①显微镜的安置：置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘约10cm左右，镜检时姿势要端正。

②光源调节：安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，若使用反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或平面反光镜并调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。

③双筒显微镜的目镜调节：根据使用者的个人情况，双筒显微镜的目镜间距可以适当调节，而左目镜上一般还配有屈光度调节环，可以适应眼距不同或两眼视力有差异的不同观察者。

④聚光器数值孔径值的调节：正确使用聚光镜才能提高镜检效果。聚光镜的主要参数是数值孔径，它有一定的可变范围。一般聚光镜边框上的数字代表它的zui大数值孔径，通过调节聚光镜下面可变光栏的开放程度，可以得到各种不同的数值孔径，以适应不同物镜的需要。

2）显微观察：进行显微观察时应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察顺序。

①低倍镜观察：将金黄色葡萄球菌染色标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。下降10倍物镜，使其接近标本，用粗调节器慢慢升起镜筒，使标本在视野中初步聚焦，再用细调节器调节使物像至清晰。通过玻片夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到的结果。

②高倍镜观察：在低倍镜下找到合适的观察目标，并将其移至视野中心后，将高倍镜移至中心位置。对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后微调细调节器使物像清晰，利用推进器移动标本找到需要观察的部位，并移至视野中心仔细观察或准备用油镜观察

③油镜观察：在高倍镜或低倍镜找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心的将下，使油镜浸在油中，并几乎于标本接触时止（注意：切不可将油镜压到标本，否则不仅压碎玻片，还会损坏镜头）。将聚光器升至zui高位置并开足光圈（若所用聚光器的数值孔径值超过1.0，还应在聚光镜与载玻片之间也加滴香柏油，保证其达到的效能），调节照明使视野的亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。

3）显微镜用后的处理及维护

①上升镜筒，取下载波片。先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸取少许二甲苯擦去镜头上的残留油迹，然后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，zui后用绸布清洁显微镜的金属部件。将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，再向下旋。同时把聚光镜将下以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险，套上镜套，放回原处。

②显微镜是很贵重和精密的仪器，使用是要十分爱惜，各部件不要随意拆卸。搬动显微镜时应一手托镜座，一手握镜臂，放于胸前，以免损坏。

③显微镜放置的地方要干燥，以免镜片生霉；亦要避免灰尘，在箱外放置暂时不用时，要用纱布等盖住镜体。显微镜应避免阳光曝晒，并须远离热源。