猪瘟病毒抗原检测试剂盒说明书 Classical Swine Fever Virus Antigen Test Kit (CSFV Ag) 用途 HerdChek 猪瘟病毒抗原检测试剂盒/血清,是根据酶联免疫反应原理设计的、用于检测血清、血浆中猪瘟病毒抗原的一种诊断试剂盒。 概述 牛病毒性腹泻病毒（BVDV）, 边界病毒（Border Disease Virus BDV）和猪瘟病毒（CSFV）是同属于黄病毒科瘟病毒属的3 个成员。猪瘟由于其高度的病原性和广泛的致死性，对养猪业造成严重的损失。感染高致病力猪瘟病毒后，猪在出现症状前会排出大量的病毒。耐过急性或亚急性的感染的动物会产生抗体并且不再散毒。低致病力温和病毒会造成猪的慢性的感染，病猪将会持续或间歇排出病毒直至死亡。 怀孕母猪与猪瘟病毒接触后可能通过胎盘感染胎儿。先天性的感染可能导致流chan，木乃伊胎儿，死产和/或弱仔及畸形胎儿。猪也有可能感染BVDV 或BDV，尽管这些感染通常呈温和经过并且是自限性的,而且很难检测到病毒。HerdChek CSFV 抗原检测试剂盒对瘟病毒属病毒有*的敏感性，不能区分BVDV 或BDV 抗原，阳性检测结果需要用CSFV 特异的方法确认。 此试剂盒只用于兽医体外诊断。 原理 HerdChek 猪瘟病毒抗原/血清是为检测血清和血浆样品中的猪瘟病毒抗原(Ag)设计的酶联免疫吸附试验。这个微量滴定的形式是将猪瘟病毒(Erns)的单克隆抗体包被于微量板上装配而成的。样品中的猪瘟病毒抗原被捕获在板子上。在将检测样品于微孔中孵育之后，捕获的猪瘟病毒抗原由瘟病毒特异性抗体和辣根过氧化物酶标记物来检测。然后，没结合的酶标记物被洗掉，再加入底物和/色原体溶液。在酶的存在下，底物转化为可以与色原体发生反应的产物并产生蓝色。在加了终止液之后，产生黄色。用分光光度仪检测在450 nm [A(450)]下的单波长或者450 nm 和 650 nm [A(450/650)]双波长下的吸光值。样品的校正OD 值由检测样品得到的吸光值和阴性对照的校正吸光值来计算 试剂 所有试剂要保存在2－8℃。 1. Ems 单克隆抗体包被的微量反应板 2 板 5 板 2. 阳性对照1.6 ml 2 ml 3. 阴性对照1.6 ml 2 ml 4. 辣根过氧化物酶标记物25 ml 60 ml 5. 检测抗体 15 ml 30 ml A. 10 倍浓缩洗涤液125 ml 480 ml B. TMB 底物溶液20 ml 60 ml C. 终止液20 ml 60 ml 自备器材 ·的吸管或微量移液器，用来吸取10～1000微升(μl)的液体。 ·微量移液器使用的吸头。 ·用来稀释洗涤液的500ml量筒。 ·适用96孔微量反应板的酶标仪。 ·蒸馏水或去离子水。 ·滴加和吸去洗涤液的设备 ·可以盛装液体和消毒液的容器 ·温箱或封板器 ·振荡器 注意事项 ·把它当作潜在的传染源来处理所有的生物材料。 ·禁用嘴吸液。 ·处理样品和试剂盒的地方禁止饮食和吸烟。 ·底物溶液对眼睛、皮肤以及呼吸系统都有刺激作用，在使用过程中要防止该溶液接触眼睛和皮肤。 ·终止液中含有1M HCl,容易引发烧伤。要小心处理。 ·避免底物TMB照到强光，或接触到氧化剂。盛装TMB溶液的容器要用干净的玻璃或塑料器皿。 ·所有试剂一律放置2-8℃ 保存。所有试剂用前恢复至室温18-25℃，用完后返回到2-8℃以便下次使用。 ·用过的材料要无害化处理。 ·使用处理各个试剂时要小心操作，严防对试剂的污染。 ·不要使用过期的试剂盒；禁止非同批试剂盒混用。 ·严格按照操作程序，仔细地吸液、计时、充分洗涤，对于获得和准确的结果是非常必要的。 ·每次检测均要加做2个阴、阳性对照。 ·在检测中，试剂的准备应用双蒸水或去离子水配制。 ·没有用完的微量反应板应贮存在密封塑料袋内，于2-8℃存放。 ·仅供兽医。 试剂准备 洗涤液制备 10 倍浓缩的洗涤液在使用前必须让它恢复到室温，使用时要摇匀使析出的盐溶解，并用蒸馏水或去离子水进行10 倍稀释（如:30ml 的浓缩洗涤液要加270ml 的水并充分混匀）。无菌条件下制备的洗涤液在2-8℃可保存1 周。 样品准备 血清和血浆(新鲜或冻结)都可用于检测。 操作步骤 在使用之前，所有的试剂盒组分都必须恢复到室温（18－25℃）。试剂应通过轻轻涡旋、旋转混合均匀。 每个样本都使用不同的吸头。 1. 取出用抗体包被的微量反应板，并在纪录表上标记好每个样本的位置。 2. 在每个反应孔中加入50μl 的检测抗体。可以用移液器（8 或12 道）加样。 3. 在阴性对照的双孔中各加50μl 阴性对照。 4. 在阳性对照的双孔中各加50μl 阳性对照。 5. 在剩下的反应孔中分别加入50μl 被检样品。对于不同的被检样品要更换吸头。 6. 轻弹微量反应板或用振荡器振荡，将反应板中的溶液混匀。 7. 在37℃的条件下孵育2 小时，也可在2－8℃的条件下孵育过夜（12-18 小时于冰箱中）。在孵育过程中应将微量反应板封闭或在湿盒内孵育，以防反应孔中的液体蒸发。 8. 吸出反应孔中的液体物质并弃入废液缸中。 9. 每个反应孔加入约300μl 的洗涤液进行洗涤，洗涤五次。每次洗涤后吸出所有孔中的液体。在洗涤时以及在加辣根过氧化物酶标记物之前要防止反应板出现干燥现象。在zui后一次洗涤完后，将反应板在吸水 性强的物质上拍干。 10. 在每个反应孔中加入100μl 辣根过氧化物酶标记物。 11. 在室温下（18－25℃）孵育30 分钟。 12. 重复步骤8 和9。 13. 在每个反应孔中加入100μlTMB 底物。 14. 在室温（18－25℃）条件下于黑暗处孵育10 分钟。在加完*个孔后开始计时。 15. 在每个反应孔中加入100μl 的终止液终止反应。在加终止液时要按第13 步的顺序进行滴加。 16. 将酶标仪在空气中调零。 17. 于450nm 单波长或450nm 和650nm 双波测定样本以及对照的吸光值。 18. 计算结果。 结果 阳性对照OD 的平均值（PCx）与阴性对照OD 的平均值（NCx）之差（P-N）必须大于或等于0.150OD，另外阴性对照OD 的平均值（NCx）必须小于或等于0.250 OD，这样实验结果才算成立。 若试验结果失败，有可能是实验操作失误造成，应按操作说明进行重复试验。 判断各样品是否含有待测抗原主要通过计算修正OD 值（S-N）来决定的。 |
