α-葡萄糖苷酶（α-GC）试剂盒说明书

α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase, α-GC）试剂盒说明书
分光光度法 50 管/24 样
正式测定前务必取2-3 个预期差异的样本做预测定
测定意义：
α-GC(EC 3.2.1.20)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化水解芳基或烃基与糖
基之间的α-糖苷键生成葡萄糖，不仅与细胞壁的松弛或加固有关，而且与细胞识别和一些
信号分子产生密切相关。
测定原理：
α-GC 分解对-硝基苯-α-D 吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm 有zui大吸收峰，通
过测定吸光值升高速率来计算α-GC 活性。
自备用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸
馏水。
试剂组成和配制：
提取液：液体50mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂×2 瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入10mL 蒸馏水，充分溶解备用；用不完的
试剂仍-20℃保存。
试剂二：液体25mL×1 瓶，4℃保存。
试剂三：液体50mL×1 瓶，4℃保存。
粗酶液提取：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量
（104 个）：提取液体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500 万细菌或细胞加入1mL 提
取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30 次）；
15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，
加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、 分光光度计预热30min 以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。
2、加样表
试剂名称（μL） 测定管 对照管
试剂一 400
试剂二 500 500
样本 100 100
充分混匀，放入37℃准确水浴30min 后，立即放入95℃水浴5min（盖紧，以防止
水分散失），流水冷却后充分混匀（以保证浓度不变）
试剂一 400
充分混匀，8000g，4℃，离心5min，取上清液
上清液 500 500
试剂三 1000 1000
充分混匀，室温静置2min 后， 400nm 处测定吸光值A，计算ΔA=A 测定管-A 对照管。每
个测定管需设一个对照管。
α-GC 活力计算：
标准条件下测定的回归方程为y =0.00543x -0.0027；x 为标准品浓度（nmol/mL），y 为吸光
值。
（1）按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟产生1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
α-GC 活力(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T
=61.39×(ΔA+0.0027) ÷Cpr
需要另外测定，建议使用本公司BCA 蛋白质含量测定试剂盒。
（2）按样本鲜重计算：
单位的定义：每g 组织每分钟产生1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
α-GC 活力(nmol/min /g 鲜重)＝[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T
=61.39×(ΔA+0.0027) ÷W
（3）按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每1 万个细菌或细胞每分钟产生1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
α-GC 活力(nmol/min /104 cell)=[(ΔA+0.0027) ÷0.00543×V 反总]÷(500×V 样÷V 样总)÷T
=0.123×(ΔA +0.0027)
V 反总：反应体系总体积，1mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.1mL；V 样总：加入
提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g； 500：细胞或细菌
总数，500 万；T：反应时间，30min。