信帆生物为你答疑解惑：凝血酶的产品应用，凝血酶的标签切割

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凝血酶（Thrombin）
规格：10000U
保存：2-8℃保存，有效期3 年。

溶解方法：
可用生理盐水（0.9% NaCl溶液）配制，储存液参考浓度为1000U/ml，-20℃保存可稳定6个月。
为避免反复冻融，可分装冻存。

产品应用：
一、凝血实验
凝血酶（Thrombin）来源于牛血浆，分子量37KD，是由两条肽链（31KD 和6KD）通过二硫键
组成的。凝血酶是凝血酶原（凝血因子Ⅱ）激活后形成的蛋白质水解酶，其催化纤维蛋白原
（fibrinogen）水解掉A 肽和B 肽，由此形成纤维蛋白单体，单体进一步聚合，在血小板、红细胞
和白细胞等参与下形成血凝块。

凝血酶酶活：固体活力：50-200 单位/mg solid；比活力：比活力大于2000 单位/mg protein；
酶活检测方法：以纤维蛋白原为底物，按2010 版药典凝血酶冻干粉检测。
产品稳定性好：冻干产品在室温条件下考察12 个月，酶活力未见显著变化，冷藏条件下保存
36 个月，酶活力未见显著变化。

信帆生物为你答疑解惑：凝血酶的产品应用，凝血酶的标签切割

二、标签切割
由于凝血酶具有切割序列专一性强，水解效率高的特点，它也被广泛地应用于基因工程产品的
开发，其应用之一是作为工具蛋白酶用于重组融合蛋白质的特异性断裂，尤其适用于生物工程制药
业及基因工程、生物化学、分子生物学等研究。
凝血酶是一种广泛用于切割标签的蛋白酶，凝血酶切割位点是X4-X3-P-R[K]-X1'-X2',这里
X4 和X3 是疏水氨基酸而X1'和X2'是非酸性氨基酸，一些经常使用的识别位点是
L-V-P-R-G-S,L-V-P-R-G-F,和M-Y-P-R-G-N。在X4-X3-P-R-G-X2'之间切割比在X4-X3-P-K-L-X2'更
有效。其他识别位点是X2-R[K]-X1', 这里X2 或者X1'是甘氨酸，例如A-R-G 和G-K-A，这里切
割发生在第二个残基后。在凝血酶切割位点和N 末端标签之间插入五个甘氨酸残基可改善切，通过
这一"甘氨酸连接肽"只需较少酶量就可达到*切割，而且也可以避免可能发生的错误切割。
作为切割标签的蛋白酶具有以下特点：
1. 纯度高：SDS-PAGE 检测图谱无杂蛋白条带；
2. 不含有其他蛋白酶活性；
3. 酶切活性高，能够有效切质量比为1:1000 的蛋白。切割可在20℃到37℃之间切割0.3 到16 小
时。
4. 有效的酶切缓冲液是20mM Tris-HCl 缓冲液,含150mM 氯化钠，pH8.0。
5. 凝血酶可从切割产物中用p-氨基琼脂糖亲和纯化,或者苯甲脒琼脂糖移去。
酶切条件：
凝血酶酶切条件举例：20mM Tris-HCl缓冲液，含150mM NaCl，pH8.0体系中：
融合蛋白总量100μg
凝血酶用量0.2-0.3U
温度20℃-37℃
酶切时间0.3h-16h
根据底物蛋白酶切位点的差异，可以适当调整凝血酶的工作浓度与酶切时间，以便达到较好的
酶切效果。
凝血酶切割样品SDS-PAGE 比较图谱：
泳道1 为切割前样品，泳道2 为采用sigma 凝血酶切割后样品，泳道3、4 为采用
sigma 凝血酶切割后样品，泳道5、6 为采用自制凝血酶切割后样品。

SDS-PAGE 图谱：泳道1 为自制凝血酶（非还原），泳道2 为sigma 公司凝血酶（非还原）；泳道3
为自制凝血酶（还原），泳道4 为sigma 公司凝血酶（还原）

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