上海信帆提供免疫组化实验代测服务

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免疫组化实验代测
免疫组化，是应用免疫学基本原理一抗原抗体反映，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反映使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术（immunohistochemistry）或免疫细胞化学技术（immunocytochemistry）。

服务说明

冰冻切片免疫组化实验步骤

1、 冰冻切片固定：冰冻切片室温晾干，置于冷丙酮固定10min，于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

2、 抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH9.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中低火10-15min，断电间隔10min转至中低火10-15min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复条件根据组织来确定）

3、 阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%过氧化氢溶液，室温避光孵育25min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、 BSA或者血清封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用3%BSA或者10%正常兔血清均匀覆盖组织，室温封闭30min。（一抗是山羊来源用10%正常兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭）

5、 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

6、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加组化试剂盒内与一抗相应种属的二抗（HRP标记）覆盖组织，室温孵育50min。

7、 DAB显色：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。

8、 复染细胞核：Harris苏木素复染3min左右，自来水洗，1%的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。

9、 脱水封片：将切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min --无水乙醇Ⅰ6min -无水乙醇Ⅱ6min -二甲苯Ⅰ5min 中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

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石蜡切片免疫组化实验步骤

1、 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。

2、 抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液（PH9.0）的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8min至沸，停火8min保温再转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3、 阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%过氧化氢溶液（双氧水：纯水=1:9），室温避光孵育25 min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、 BSA或者血清封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用3%BSA或者10%正常兔血清均匀覆盖组织，室温封闭30min。（一抗是山羊来源用10%正常兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭）

5、 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

6、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗（HRP标记）覆盖组织，室温孵育50min。

7、 DAB显色：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。

8、 复染细胞核：Harris苏木素复染3min左右，自来水洗，1%的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。

9、 脱水封片：将切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min --无水乙醇Ⅰ6min -无水乙醇Ⅱ6min -二甲苯Ⅰ5min 中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。

10、 显微镜镜检，图像采集分析。

几种常用的免疫组织化学方法的原理

免疫荧光细胞化学技术

将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原,在荧光显微镜下观察.当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后会发出一定波长的荧光,从而可以确定组织中的抗原定位或定量.

免疫酶细胞化学

是目前免疫组织化学研究中zui常用的技术.基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞或组织内的相应抗原进行定位或定性研究.

免疫胶体金技术

就是用胶体金标记一抗，二抗或其他的能特异性的结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，对组织或细胞内的抗原进行定性，定位或定量研究.由于胶体金的电子密度高，多用于免疫电镜的单标记或多标记的定位研究.

免疫组织化学的全过程包括：①抗原的提取与纯化;③免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化;③将显色剂与抗体结合形成标记抗体;④标本的制备;③免疫细胞化学反应以及呈色反应;⑧观察结果。

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二、免疫组织化学基本技术

1.材料

免疫组织化学可用于多种材料.如实验动物,人体组织,细胞和体外培养细胞都可用于免疫组化研究.

一.)实验动物　种类很多，以狗，兔，大鼠和小鼠zui为常用.关键是取材迅速，大小适宜，固定充分.

二.)人体材料　包括活检和手术切除的标本，以及通过各种手段收集的细胞都可用于免疫组化研究.如　脱落细胞　穿刺涂片　骨髓涂片　血涂片等.

三.)体外培养的细胞标本　根据所培养细胞的生物学特性采用不同的方法.对于贴壁生长的细胞可采用在培养瓶或培养皿底部放置载玻片，让细胞在其上面生长，到时将载玻片取出进行固定，染色.悬浮生长的细胞可采用离心涂片或离心后细胞团块固定，脱水，包埋，切片的方法进行免疫组织化学研究。

2 .固定

固定的目的在于保持组织的形态和结构的完整，尽量保存组织中的抗原，使其不被破坏或扩散，以减少非特异性染色或假阳性，假阴性的结果.

选择固定方法的原则是:

在保持组织形态的完好和被检测抗原的前提下,尽量应用浓度zui低的固定剂及zui短的固定时间.

常用固定剂

一.)醛类固定剂 起作用是使组织之间相互交联,将抗原保存在原位.此类固定剂的特点是对组织的穿透力强,组织收缩性小.常用的有甲醛,多聚甲醛和戊二醛.可单用也可联合使用.

(1)3% 中性甲醛固定液液:

配制: 30%甲醛10ml, 0.01mol/L PH 7.4 PBS 90ml

特点: 渗透性好,能完好地保护组织结构和某些抗原.由于交 联作用会影响细胞膜的通透性,会遮蔽部分抗原,染 色 前用酶消化,以暴露抗原决定簇.

(2)4%多聚甲醛缓冲液:

配制: 40g多聚甲醛溶于0.1mol/L PBS 500ml, 加热 搅拌(注意不要沸腾)至溶液清亮后，室温下冷却后加PBS, 使总容量为1000ml

特点：此固定剂对抗原的保护优于甲醛缓冲液但价格高与甲醛

(3)戊二醛-多聚甲醛缓冲液

配制：在上述溶液中加入1%的戊二醛.

特点：多用于电镜的免疫组织化学研究

(4)Bouin液

配制：40%甲醛250ml，冰醋酸50ml,饱和苦味酸750ml.

特点：穿透力强，组织收缩小. 比单独用甲醛固定更适合于免疫组织化学研究

(5) PLP液 (过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液)

此固定剂比较适合富含糖类组织的固定,对超微结构及许多抗原的保存均较好, 但配制比较繁琐

二.)丙酮及醇类固定剂

固定原理是使组织中的蛋白质和糖类沉淀.此类固定剂的穿透能力强,对抗原保存较好,但对小分子蛋白质及多肽等物质的保存效果较差.常与其他固定剂 如 冰醋酸,乙醚,氯等混合使用.

(1)AAA液: 纯酒精85ml，冰醋酸5ml，浓甲醛10ml

(2)Clzrke液：纯酒精95ml，冰醋酸5ml 多用于冰冻切片的后固定

(3)Carnoy液: 纯酒精60ml，氯30ml，冰醋酸10ml. 多用于癌基因蛋白，抗癌基因蛋白等抗原 的固定保存。

(4) 丙酮：常用于冰冻切片和细胞涂片的后固定。用前在4度冰箱预冷，切片在冷丙酮中固定5～10min.

三.)其他固定剂

(1) Zenker液 适合免疫球蛋白抗原的检测。

(2) 四氯化锇液 是电镜研究中所必需的固定液

选择*固定剂的标准是：

组织形态保存良好; zui大限度地保存抗原的抗原性。中性甲醛和多聚甲醛是应用zui广的固定剂。

3. 包埋

包埋的目的是使组织保持一定的形状和硬度，便于用切片机切片.常见的包埋剂及方法如下:

石蜡包埋 石蜡是组织病理切片中zui常用的包埋剂. 需要脱水, 透 明,浸腊等过程.

冰冻包埋 是作冰冻切片的包埋方法. 新鲜的及以固定的材料均 适合于冰冻包埋. 常用的包埋剂是OCT

塑料包埋 常用的是环氧树脂包埋剂. 优点是同时可以作光镜和 电镜观察

碳腊包埋 较少用.包埋剂为聚乙二醇

4. 切片

因为免疫组化的步骤较多, 要求切片薄而且平整, 否则在染色过程中容易脱片.一般要求片厚在4um以下。贴片前普通的载玻片要作适当的处理。

(1)洗片 酸液浸泡过夜，流水冲洗，蒸馏水洗，95%酒精浸

泡 2h，擦干。

(2)涂胶 常用的防脱片剂有：多聚赖氨酸，APES及白乳胶。

使用方法见试剂使用说明书。

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