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免疫印迹Western Blot实验代测

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上海信帆代做实验项目:ELISA,免疫组化,免疫印迹Western Blot,放射免疫,实时荧光定量PCR,,免疫组织,特殊染色,病理学检测技术服务等等!我们拥有的实验室,客户检测项目均提供实验室仪器型号,提供操作详细步骤.欢迎!免疫印迹Western Blot实验代测

免费咨询:021-51870610

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免疫印迹Western Blot实验代测

免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting),它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性,现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。
凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA-electrophoretic mobility shift assay)是一种研究DNA 结合蛋白和其相关的DNA 结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。这一技术zui初用于研究DNA 结合蛋白,目前已用于研究RNA 结合蛋白和特定的RNA 序列的相互作用。

Western blot 检测 1400元/膜每张膜1--8样本
EMSA   2800元/膜 每张膜1--8样本,包括探针及试剂


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Western Blot实验
成功完成Western Blot检测,必须满足4个条件:

凝胶洗脱:转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来,如果蛋白质还截留在凝胶中,将无法在膜上进行分析

吸附到膜上:在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上,如果蛋白不吸附,将无法在膜上进行分析

处理期间仍截留在膜上:在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上

处理过程中可接近:被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触,如果蛋白质被掩盖则无法检测

成功进行WB检测,则设置合适正确的对照是*的,只要正确设置了这些对照,即可快速和准确的找到WB的问题所在,并保证实验结果的准确性和特异性!一般需要设置的对照如下:

阳性对照:明确表达检测蛋白的组织或细胞,用于检测抗体的工作效率

阴性对照:明确不表达检测蛋白组织或细胞,用于检测抗体的特异性

二抗对照:不加一抗,用于检测二抗的特异性

内参对照:检测标本的质量和二抗系统

空白对照:不加一抗和二抗;用于检测膜的性质和封闭的效果

WB 检测基本过程

1 、获取细胞或组织裂解物

1)根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer:

蛋白位置
buffer
全细胞
NP-40 or RIPA
胞浆(可溶性蛋白)
Tris-HCl
胞浆(骨架结合蛋白)
Tris-Triton
膜蛋白
NP-40 or RIPA
核蛋白
RIPA or 核蛋白提取试剂盒
线粒体蛋白
RIPA or 线粒体分离试剂盒

亦可购买商业化的蛋白提取试剂盒来保证标本制备的质量

2)选择合适的蛋白酶抑制剂,避免蛋白降解,从而保证检测的准确性!

2 、蛋白定量

常用的蛋白定量方法:Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后,可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C备用,进行免疫沉淀(IP)或者直接进行电泳分离蛋白

3 、电泳分离蛋白质

根据待测蛋白状态确定电泳条件:

待测蛋白状态
凝胶条件
上样buffer
电泳buffer
Reduced - Denatured
还原,变性
含β-巯基乙醇或DTT,含SDS
含SDS
Reduced - Native
还原,不变性
含β-巯基乙醇或DTT,不含SDS
不含SDS
Oxidized - Denatured
不还原,变性
不含β-巯基乙醇或DTT,含SDS
含SDS
Oxidized - Native
不还原,不变性
不含β-巯基乙醇或DTT,不含SDS
不含SDS

根据待测蛋白分子量大小确定凝胶浓度

蛋白分子量(kDa)
凝胶浓度(%)
4-40
20
12-45
15
10-70
12.5
15-100
10
25-200
8

4 、转膜

根据不同的检测目的和待测蛋白的特性,选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有:PVDF膜、硝酸纤维素膜(NC膜)和尼龙膜,其中PVDF和NC膜的使用频率zui高。各种膜的技术参数及比较如下:

 
PVDF膜
NC膜
尼龙膜
灵敏度和分辨率



背景


较高
蛋白结合能力
100-200ug/cm2(适用于SDS存在时与蛋白结合)
80-100ug/cm2
>400ug/cm2
机械强度

干的膜易脆
软而结实
溶剂抗性



使用前是否需要浸润
100%甲醛润湿
缓冲液润湿
缓冲液润湿
适用染色方法
胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁、考马斯亮兰
胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁
不能用阴离子染料
适用检测方法
显色法、化学发光、荧光、放射性、化学荧光、快速免疫检测
显色法、化学发光、荧光、放射性
显色、化学发光、放射性
适用范围
普通蛋白WB、糖蛋白检测、蛋白质测序、氨基酸分析、重复检测
普通蛋白WB、氨基酸分析、重复检测。0.1um膜适用于7kDa以下蛋白
低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸检测常用
价格

较低

5 、封闭

去掉膜上多余的非特异性结合位点,降低背景。常用的封闭溶液有:含BSA或者脱脂奶粉的TBST或TBS

6 、一抗孵育

一抗的选择成功与否,是整个WB实验成功的关键:选择一抗有以下几个注意点:

选择适合检测标本种属的一抗(说明书有验证)

选择适用于WB实验方法的一抗(说明书有验证)

选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体

免疫印迹Western Blot实验代测

一抗的保存和使用:

根据说明书的要求条件进行抗体的保存;一般需要将抗体分装后放入-20度保存,避免反复冻融。

抗体的工作液现配现用,在4度保存不要超过2周

根据说明书浓度使用TBST稀释一抗。由于实验室条件和检测方法等的差异,说明书的稀释比例只作参考,需要在说明书的浓度周边进行多个浓度梯度的实验检测,然后选择信噪比的抗体浓度进行实验。如果说明书没有浓度,可进行多个稀释比例进行摸索稀释度(1:100-1:3000)。

孵育条件:4°C孵育过夜(一般大于18个小时),根据抗体亲和力不同孵育时间有所区别

内参的选择和使用:WB 过程监测以及目的蛋白定量的标准!

WB常用内参及其技术参数:

内参名称
分子量大小
适用范围
beta-actin
43kDa
胞浆和全细胞
GAPDH
30-40kDa
胞浆和全细胞
Tubulin
55kDa
胞浆和全细胞
VCDA1/Porin
31kDa
线粒体
COXIV
16kDa
线粒体
TBP
38kDa
细胞核

详情请参考

7 、二抗孵育

根据说明书浓度使用TBST稀释一抗。如果说明书没有浓度,可进行多个稀释比例进行摸索稀释度(1:1000-1:20000)。孵育条件一般为室温1-2小时

8 、底物孵育

选择显色或者化学发光底物。一般倾向于化学发光,灵敏度高且背景低,节省抗体用量

9 、结果分析和检测

凝胶成像系统检测或者暗室曝光到胶片

注意事项
1、 抗体:事先咨询信帆生物,明确抗体种属及指标名称,确定我司抗体库否有该抗体可使用,如有一抗可免费提供,如无可由双方协商而定,客户自己购买提供或我公司代购;
2、 标本收集与保存:
组织样品  新鲜组织放入液氮或-70度保存,组织不少于100mg(约绿豆大小);
培养细胞  通过细胞计数取不少于100万个细胞于EP管,加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂,混匀后保存于冰箱(-70℃,避免反复冻融);
血液细胞标本  以抗凝管保存血样或以淋巴细胞分离液分离细胞后加入0.5ml生理盐水或蛋白保护剂,保存(-70℃可保存,避免反复冻融)
血清或细胞培养液标本  离心去掉杂质后取上清入EP管,保存(以上4℃可保存15-20天,-70℃可保存,避免反复冻融)
3 、 样本运输:可选以下任何的一种方式寄送标本
组织样本、细胞样本以干冰运输或加入蛋白保护剂后加冰袋运输;
细胞样本也可以直接快件寄送培养瓶(密封保证不污染,培养液不漏出,细胞不要长得太满,50%左右,灌满培养液);
血清或上清液直接加冰袋寄送(密封保证液体不漏出,视路途远近2-3天可到达)。

流程:
1、客户告知实验分组、编号、检测样本类型、种属、指标,有具体要求请事先说明;
2、签订合同,寄送样本和抗体,如需我方提供抗体请事先说明;
3、客户支付预付款,进行实验。
4、提供原始数据,分析数据,实验室仪器型号,所用试剂品牌货号,图片,实验报告等!

 

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