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免疫组化实验代测,IHC实验技术服务

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上海信帆生物,提供免疫组化检测服务,代测时间为10天,欢迎客户朋友们,来电来函!免疫组化代测,免疫组化实验代做,提供实验数据,实验报告,实验室所用仪器型号等。免疫组化实验代测,IHC实验技术服务

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免疫组化实验代测,IHC实验技术服务,免疫组化操作步骤
 

 一 免疫组化(LP 法)操作步骤

  1. 切片常规脱蜡至水。如需抗原修复,可在此步后进行

  ⒉ 缓冲液洗 3min/2 次。

  ⒊ 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色,将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。

  ⒋ 缓冲液洗 5min/2 次。

  ⒌ 滴加 Ultra V Block , 在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。

  (注:孵育不要超过 10 分钟,否则会导致特异性染色降低。如果一抗的稀释液中含有 5 - 10% 正常羊血清,这一步可以省略。)

  ⒍ 缓冲液洗 5min/2 次。

  ⒎ 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 - 2 小时。(具体孵育时间和温度由试验者zui终决定)

  ⒏ 缓冲液洗 5min/2 次。

  9 . 滴加 Primary Antibody Enhancer(增强子),在室温下孵育 20 分钟。

  10 .缓冲液洗 5min/2 次。

  11 .滴加 HRP Polymer(酶标二抗) ,在室温下孵育 30 分钟。

  (注:HRP Polymer 对光敏感,应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。)

  12 .缓冲液洗 5min/2 次。

  13 .向 1ml DAB Plus Substrate (或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen (或 AEC Plus Chromogen),混匀后滴加到切片上,孵育 3 - 15 分钟。(具体时间由染色深浅决定。)

  14 .自来水充分冲洗,复染,脱水,透明,封片。

 

二.免疫组化主要步骤
1. 洗载玻片:将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中,目的是为了是载玻片上的硅胶等除去,同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整,便于组织吸附,然后置于清水中清洗,除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4(大约冲一个小时左右),再将载玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C温箱中,将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面,由于Lys带正电,而大多数的组织带负电荷,从而产生吸附作用。
2. 包埋组织:先在铁模具中加入一些液态石蜡,先稍微冷却,然后再将待包埋的组织置于石蜡之中,并排列整齐,再将塑料模具盒盖上,zui后加入少许液体石蜡,进行冷冻,使石蜡变成固态。
3.切片:将包埋好的组织从模具上取下来,并置于石蜡切片机上,切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向*,然后调节切片的厚度,一般为5µm,如果比较难切,则可以适当调整厚度,用毛笔将切割的载玻片向外拉,并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于40°C温水中。
4. 捞组织:当组织载玻片置于40°C温水中之前,要先将水浴中的气泡赶走,以免气泡受热上浮而贴到组织上,组织受热展开,是组织不起皱纹,用载玻片捞组织时,一般取载玻片的下1/3或者下1/2一般每种组织捞5-6张,其中2-3张是备用的,每张载玻片上通常捞两份组织,做对照使用,这样形成的误差就比较小了,而且捞载玻片的时候方向*,以便观察,再将捞出来的载玻片置于架子上,放入37°C温箱中烘干。
5. 脱蜡:依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精,起脱蜡作用的主要是二甲苯,依据的是相似相溶的原理.一般在每个试剂中放10min,天气热可以少放几分钟,相反,天气较冷的话,就要适当延长脱蜡时间,一般为12-15min.
6.抗原修复:脱蜡后在清水中冲洗一段时间,加入3%H2O2浸泡10min,从而除去内源性的过氧化氢酶,然后倒掉H2O2,在清水中洗两次,再加入柠檬酸缓冲液,放入微波炉中蒸煮3min(中火),一般刚到沸腾即可,冷却至室温,然后再蒸煮一次,冷却至室温,蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。
7.血清封闭:冷却至室温后,将柠檬酸缓冲液倒掉,水洗2次,并将载玻片置于PBS中5min,洗2次,擦干组织周围的PBS液,马上加上血清,使一些非特异性的位点封闭起来,然后放入37°C温箱中半小时。血清稀释10倍(900µlPBS:100µl血清封闭液)。
8. 加一抗:将温箱中的载玻片取出,用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清,加一抗,如果做对照实验,就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存过一夜。
9. 加二抗:将载玻片从冰箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5min,擦干组织周围的PBS后加上二抗,然后置于37°C温箱中半小时。
10. 加SABC:将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次,每次5min,擦干组织周围的PBS后加上SABC, 然后置于37°C温箱中半小时。SABC稀释100倍(990µlPBS:10µlSABC)。
11. 加显色剂:将片子从温箱中取出, 放入PBS中洗3次,每次5min,擦干组织周围的PBS后加上显色剂。(显色剂的配置:在1ml水中加1滴显色剂A,摇匀,然后加1滴显色剂B,摇匀,再加1滴显色剂C,摇匀)

 A:DAB        B:H2O2        C:磷酸缓冲液
12. 复染:将显色后的片子用清水冲洗一段时间后,浸泡于苏木精中染色,一般动物组织为半分钟,植物组织3-5min。
13. 脱水:将复染后的片子置于水中冲洗后,依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min,zui后浸泡在二甲苯中,搬到通风柜中。
14. 封片:用中性树胶滴在组织旁边,再用盖玻片盖上,要先放平一侧,然后轻轻放下另一侧,以免产生气泡,封好片子后置于通风柜中晾干。

免疫组化实验代测,IHC实验技术服务

三. 免疫组化染色步骤

  冰冻切片 4-8um ,室温放置 30 分钟后,入 4 ℃丙酮固定 10分钟,PBS洗,5分钟x3,用过氧化氢孵育5-10分钟,消除内源性过氧化物酶的活性。

免疫组化代测,免疫组化实验代做,免疫组化操作步骤

四:如何实现*的免疫组化实验 
 
1 .固定 :用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片,甲醛固定有时比冰冻丙酮好;但对于不同的组织和抗原 ,可选用不同的固定液。 有时候商品化的抗体会有比较适合而的固定液,请于购置前注意说明书。
Bouin S固定液:饱和苦味酸750ml,甲醛250ml,冰醋酸50ml,其对组织的穿透力较强,固定较好,结构完整,但因偏酸,对抗原 有一定损害,且组织收缩明显,不适于组织标本的保存。 PLP液:即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛,适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织,对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。

2 .组织脱水,透明 :时间不能太长,否则在切片时容易碎片,切不完整。

3 .切片时展片: 有些组织在切片后难以在水中展开,这时可适当地在水中加入几滴乙醇。

4 .烤片: 60℃ 30分钟或37℃ 过夜,温度太高或时间太长,抗原 容易丢失。

5 .蜡块及切片的保存: 在4℃保存

6 .脱片问题 : Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化 染色工作中zui常用的一种防脱片剂,6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液,适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行,可用双重处理(APES和Poly-L-Lysine)的切片。在以上两种条件都行不通的情况下,可用如下方法:切片在脱蜡前,放在APES 1:50 丙酮溶液中浸泡3分钟,晾干,即可进行下一步。

7 .灭活内源性酶: HRP系统:3%双氧水灭活;AP系统:3%HAc灭活。

8 .暴露抗原 : 对于石蜡切片的免疫组化实验时,必须采用高温加热抗原修复,这将有助于暴露抗原决定簇,从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的修复液请参阅抗体说明书)。对于不同的组织,不同的抗原,不同的抗体,所采用的方法应不一样,可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。

9 .封闭: 在山羊血清封闭,非特异性染色仍然较强时,可延长封闭时间或用浓缩血清封闭

10 .抗体稀释: 应遵循“现用现配”的原则,对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。

11 .背景高: 在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下,如果背景依旧高,可采用含1‰ Tween20的PBS洗,特别是在显色之前要多洗。

12 .返蓝: 在苏木素复染后,可用碱性缓冲液(如PBS)或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。

13 .显色: 一定要在显微镜下观察,注意控制背景。
14. 在整个操作过程中,切片千万不能干燥,否则会有非特异性染色。

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