γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCL）实验代测

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γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCL）实验代测

检测意义：GCL是GSH合成的限速酶，GSH对GCL有反馈抑制作用。GCL基因表达受多种因素调节，如氧化剂、抗氧化剂、生长因子和炎症因子等。GCL活性高低对GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影响。
检测原理：在ATP和Mg2+存在下，GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸；同时ATP去磷酸化产生无机磷分子，通过测定无机磷增加速率，即可计算出GCL活性。
自备仪器及用品：冷冻离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、浓硫酸和蒸馏水。
试剂组成及配置：试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。 
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加6mL蒸馏水充分震荡溶解。 
试剂三：粉剂×1 管，4℃保存。临用前加入蒸馏水1.5mL充分震荡溶解。 试剂四：液体×1 瓶，室温保存。 试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入12 mL蒸馏水，充分震荡溶解后，缓缓加入400µL
浓硫酸（自备），边加边搅拌。
粗酶液提取： 
1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加
入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500
万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。血清等液体：直接测定。

γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCL）实验代测