胶原蛋白酶2,9检测试剂盒

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胶原蛋白酶2,9检测试剂盒

试剂盒采用酶谱法(zymography)检测MMP-2、MMP-9活性。Zymography是一种广为使用的、基于SDS-PAGE电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法，其灵敏度可达1 nM，高于ELISA方法²，其基本原理和程序是：制备加有胶原酶底物的SDS-PAGE凝胶，含蛋白酶的样品在此凝胶中进行电泳，电泳结束后取出凝胶与酶反应Buffer孵育，凝胶染色与脱色。凝胶中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶条带的位置，蛋白酶降解凝胶中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮区域，从而能同时指示MMP-2、MMP-9的大小位置(酶谱)及活性。

操作步骤：

1.    制备含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝胶：分离胶浓度为8%。按照标准程序制备SDS-PAGE凝胶。将10 × substrate G 融化，90 ºC加热5分钟，分别在浓缩胶和分离胶中额外加入10 × substrate G 并使之稀释10倍，混匀后加入过硫酸铵和TEMED，等待凝胶聚合。

2.     待测样品1:1稀释于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上样。切勿加热变性，并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量，使用普通蛋白预染Marker即可。阳性对照(可选步骤)：可取人、小鼠、大鼠或兔100µl全血与100µl 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer等体积混合，取5-15µl上样。

3.    低电流恒流电泳，每一块小胶电流为20 mA。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。

4.     洗涤凝胶：取出凝胶，去除浓缩胶，放入容器内。可先用适量蒸馏水冲洗凝胶，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸馏水稀释)，室温漂洗凝胶2 × 18小时，中间换液。

5.     孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸馏水稀释)，室温或37ºC孵育1~5小时。阳性对照或者血中的MMP通常37ºC孵育1小时即可显示。如MMP活性低，应延长孵育时间为10小时或过夜。

6.     显色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液（操作步骤见SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书）。凝胶的大部分区域被深染，在有MMP条带的位置不被染色而形成透亮区域。透明区域的位置和范围指示MMP-2、MMP-9的大小位置(酶谱)及活性。阳性对照将在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出现透明条带。

胶原蛋白酶2,9检测试剂盒