NADH 氧化酶(NOX)测试盒 生化试剂

NADH 氧化酶(NOX)测试盒

（货号：A116-1-1 分光光度法）

一、测定意义：

NOX（EC 1.6.99.3）广泛存在于动物、植物、微生

物和培养细胞中，可在氧气存在下，直接将NADH 氧化

为NAD。该酶不仅参与NAD 的再生，而且与免疫反应

密切相关。

二、测定原理：

NADH 氧化酶（NADH oxidase，NOX）能够将

NADH氧化为NAD，NADH 的氧化与2,6 二氯酚靛蓝

（DCPIP）的还原相偶联，蓝色的DCPIP 被还原为无色

的DCPIP，在600nm下测定蓝色DCPIP的还原速率计算出

NADH 氧化酶活性的大小。

三、需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液

器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水

四、试剂的组成和配制( 50T/48 样)：

试剂一：液体50mL×1 瓶，-20℃保存。

试剂二：液体10mL×1 瓶，-20℃保存。

试剂三：液体1mL×1 瓶，-20℃保存。

试剂四：液体50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂五：液体6 mL×1 瓶，4℃保存。

试剂六：粉剂×2 瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入 5mL

蒸馏水，用不完的试剂分装后-20℃保存， 禁

止反复冻融。

五、样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

①、准确称取0.1g 组织或收集500万细胞，加入1mL试

剂一和10μL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

②、将匀浆600g，4℃离心5min。

③、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃

离心10min。

④、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从

线粒体泄漏的NOX（此步可选做）。

⑤、步骤④中的沉淀即为线粒体，加入200μL 试剂二和

2μL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，

超声3s，间隔10 秒，重复30 次），用于NOX 活

性测定。血清（浆）样品：直接检测。

六、测定步骤：

1、 分光光度计预热30min 以上，调节波长至600nm，蒸

馏水调零。

2、 样本测定：

（1）试剂四、试剂五和试剂六于37℃（哺乳动物）或

25℃（其它物种）孵育5min。

（2）在1mL比色皿中加入40μL样本、700μL试剂四、

100μL试剂五和160μL试剂六，混匀，记录600nm 处20s

时吸光值A1和1min20s 后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

七、NOX 活力单位的计算

1、血清（浆）NOX 活力的计算：

单位定义：每mL血清（浆）在每mL反应体系中每分

钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。

NOX（U/mL）＝ΔA×V反总÷V样÷0.01÷T=2500×ΔA

2、组织、细菌或细胞中NOX 活力的计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：此法需要自行测定样本

蛋白质浓度。

单位定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟

A600变化0.01定义为一个酶活力单位。

NOX（U/mg prot）=ΔA×V反总÷（V样×Cpr）

÷0.01÷T=2500×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位定义：每g 组织在每mL 反应体系中每分钟A600

变化0.01 定义为一个酶活力单位。

NOX（U/g 鲜重）=ΔA×V反总÷(W× V样÷V样

总)÷0.01÷T=505×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每1 万个细菌或细胞在每mL 反应体系

中每分钟A600 变化0.01 定义为一个酶

活力单位。

NOX（U/104 cell）=ΔA×V反总÷(500×V样÷V样总)÷0.01÷T=1.01×ΔA

V反总：反应体系总体积，1mL；

V样：加入样本体积，0.04mL；

V样总：加入提取液体积，0.202 mL；

T：反应时间，1 min；

Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；

W：样本质量；

500:细胞或细菌总数，500万。

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