丙二醛（MDA）测试盒（TBA 法） 生化试剂

丙二醛（MDA）测试盒（TBA 法）

（货号:A003-1 TBA 法）

本试剂盒是在国内外众多测试方法的基础上改进的一种微量、快速、简便、准

确、对操作人员健康无损害的测试方法。通过测试可反映出血清（浆）、乳汁等细胞

外液、红细胞、白细胞、培养细胞以及各种动植物的细胞水平及亚细胞水平的脂质

过氧化物的量。

一、测定意义：

机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂

肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA），引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过

氧化物。如：醛基（丙二醛 MDA）、酮基、羟基、羰基、氢过氧基或内过氧基，以

及新的氧自由基等。脂质过氧化作用不仅把活性氧转化成活性化学剂，即非自由基

性的脂类分解产物，而且通过链式或链式支链反应，放大活性氧的作用。因此，初

始的一个活性氧能导致很多脂类分解产物的形成，这些分解产物中，一些是无害的，

另一些则能引起细胞代谢及功能障碍，甚至死亡。氧自由基不但通过生物膜中多不

饱和脂肪酸（PUFA）的过氧化引起细胞损伤，而且还能通过脂氢过氧化物的分解产

物引起细胞损伤。因而测试 MDA 的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接

地反映出细胞损伤的程度。

MDA 的测定常常与 SOD 的测定相互配合，SOD 活力的高低间接反应了机体清

除氧自由基的能力，而 MDA 的高低又间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程

度，通过 SOD 与 MDA 的结果分析有助于医学、生物学、药理及工农业生产的发展。

二、测试原理：

过氧化脂质降解产物中的丙二醛 （MDA）可与硫代巴-比妥酸 (TBA) * 缩合，

形成红色产物,在 532nm 处有最大吸收峰。因底物为硫代巴-比妥酸（Thibabituric Acid

TBA）所以此法称 TBA 法。

三、测试所需仪器设备：

可见光分光光度计或酶标仪，可调到 95℃左右的恒温水浴箱或沸水锅，离心机，

10mL 离心管。

四、试剂盒组成与配制(50 管/48 样 A003-1-1)：

试剂一：液体 10mL×1 瓶，室温保存。（天冷时会凝固，每次测试前可 37℃加热

以加速溶解，直至透明方可应用）。

试剂二：液体 6mL×1 瓶，用时每瓶加 170mL 蒸馏水混匀，4℃冷藏。（注意不

要碰到皮肤上）。

试剂三：粉剂×1 支，用时将粉剂加蒸馏水 30mL，加热到 90℃～100℃充分溶解

后用蒸馏水补足至 30mL，再加冰醋酸 30mL，混匀，配好的试剂避光

冷藏。

标准品：10nmol/mL 四乙氧基丙烷 5mL×1 瓶，4℃冷藏。

［注］：冰醋酸（分析纯，乙酸浓度≥99.5%）；测试盒冷藏至少可保存一年。

五、试剂盒组成与配制（100 管/96 样 A003-1-2）：

试剂一：液体 20mL×1 瓶，室温保存。（天冷时会凝固，每次测试前可 37℃加热

以加速溶解，直至透明方可应用）。

试剂二：液体 12mL×1 瓶，用时每瓶加 340mL 蒸馏水混匀，4℃冷藏（注意不

要碰到皮肤上）。

试剂三：粉剂×1 支，用时将粉剂加蒸馏水 60mL，加热到 90℃～100℃充分溶解

后用蒸馏水补足至 60mL，再加冰醋酸 60mL，混匀，配好的试剂避光

冷藏。

标准品：10nmol/mL 四乙氧基丙烷 5mL×1 瓶，4℃冷藏。

［注］：冰醋酸（分析纯，乙酸浓度≥99.5%）；测试盒冷藏至少可保存一年。

六、操作步骤：

1、操作表：

离心管盖上盖，用针在盖上扎一小孔，旋涡混匀器混匀，95℃水浴（或用锅开

盖煮沸）40 分钟，取出后流水冷却，然后 3500～4000 转/分，离心 10 分钟，（3000

转/分以下离心时间需延长，目的使沉淀）。取上清***，532nm 处，1cm 光径，

蒸馏水调零，测各管吸光度值。

[注]：a*：表示所取的样品量、标准品量、无水乙醇的量、试剂一的量，四者均相等。

（a*一般取 0.1-0.2mL）

例如样品取 0.1mL 则标准品、无水乙醇、试剂一也取 0.1mL，若样品取

0.2mL 则标准品、无水乙醇及试剂一也取 0.2mL。因吸光度与加样量呈正

比曲线，故结果不受影响。

** 一般情况下，标准管、空白管及对照管每批只需做 1～2只，若样本不存在

溶血、脂血现象，则对照管可以不测，用空白管来代替对照管。

*** 吸取上清比色时最好用移液器吸取上清加入比色皿中，尽量避免倾倒，以

免沉淀进入比色皿，影响吸光度。

2、参考取样量：血清（浆）取 0.1～0.2mL。低密度脂蛋白悬液取 0.1～0.2mL 。食

油取 0.03mL。肝组织、心肌、肌肉组织、螺旋藻等，取 5％或 10%

匀浆 0.1～0.2mL 较好。

3、标准管参考吸光度：当标准品取样量为 0.1mL 时，则分光光度计测定标准管吸

光度减去空白管的吸光度为 0.065～0.070（酶标仪测定取 200μl 读数时为 0.04

左右）。当标准品取样量为 0.2mL 时，则标准管吸光度减去空白管的吸光度为

0.130～0.140（酶标仪测定取 200μl 读数时为 0.08 左右）。

4、规范操作方法及简便操作方法中，若发现检测样本吸光度太低，可以将水浴时间

40 分钟延长至 80 分钟，但您的同一课题中 MDA 的检测都必须延长至 80 分钟，

以免造成批间差异。

以免沉淀进入比色皿，影响吸光度。

[注 2]：以上规范操作法及简便操作法适用于人及各种动植物的样本（包括血清、动

植物组织及体液、细胞及细胞培养液等）。

[注 3]：规范操作方法及简便操作方法中，若发现检测样本吸光度太低，可以将水浴

时间 40 分钟延长至 80 分钟，但您的同一课题中 MDA 的检测都必须延长至

80 分钟，以免造成批间差异。

（一）、样本前处理见实验方法学中的组织匀浆处理，可制成 10%或 5%的匀浆，

但要注意，因样本量很少，所以做好的组织匀浆最好不要离心,例如培养

的细胞等破碎后可以不离心。取样时注意要摇匀后立即取样。

（二）、试剂组成与配制：

1、(100 管)微量操作法中的试剂三配制如下：

①、按规范操作方法来配制 MDA 3 号试剂：将 1 支 MDA 3 号粉剂倒入烧杯

内加 90℃～100℃的热蒸馏水 64mL*，充分溶解（溶解过程中可适当加热）。

冷却后加冰醋酸 60mL 混匀。

②、再将上述配好的 MDA 3 号试剂用 50%冰醋酸**按 2:1 进行稀释，用多少配

多少。例如您需要用微量法测 MDA 需要试剂三为 15mL，则可以取上述按规

范操作法配好的试剂三 10mL 加 50%冰醋酸 5mL，混匀即可。配好的试剂避

光 4℃冰箱冷藏（冰醋酸自备）。

［注］：* 因蒸馏水热胀冷缩，加热过程要蒸发，本应加 60mL，现多加 4mL，

冷却后在 60mL。

** 50%冰醋酸的配制是 50mL 蒸馏水加 50mL 冰醋酸混合而成的。

*** 冰醋酸又名乙酸，分析纯，乙酸浓度≥99.5%。

2、(50 管)微量操作法中的试剂三配制如下：

①、按规范操作方法来配制 MDA 3 号试剂：将 1 支 MDA 3 号粉剂倒入烧杯内

加 90℃～100℃的热蒸馏水 32mL*，充分溶解（溶解过程中可适当加热）。

冷却后加冰醋酸 30mL 混匀。

②、再将上述配好 MDA 3 号试剂用 50%冰醋酸按 2:1 进行稀释，用多少配多少。

例如您需要用微量法测 MDA 需要试剂三为 15mL，则可以取上述按规范操作

法配好的试剂三 10mL 加 50%冰醋酸 5mL，混匀即可。配好的试剂避光 4℃

冰箱冷藏（冰醋酸自备***）。

［注］：* 因蒸馏水热胀冷缩，加热过程要蒸发，本应加 30mL，现多加 2mL，

冷却后在 30mL。

** 50%冰醋酸的配制是 50mL 蒸馏水加 50mL 冰醋酸混合而成的。

*** 冰醋酸又名乙酸，分析纯，乙酸浓度≥99.5%。

（三）、操作步骤：

离心管盖上盖，用针在盖上扎一小孔，旋涡混匀器混匀，95℃水浴（或用锅开

盖煮沸）40 分钟，取出后流水冷却，然后 3500～4000 转/分，离心 10 分钟，（3000

转/分以下离心时间需延长，目的使沉淀）。取上清***，532nm 处，1cm 光径，

蒸馏水调零，测各管吸光度值。

a*表示所取的样品量、标准品量、无水乙醇的量、试剂一的量，四者均相等。例如

样品取 0.1mL 则标准品、无水乙醇及试剂一也取 0.1mL，若样品取 0.2mL 则标准品、

无水乙醇及试剂一也取 0.2mL。因吸光度与加样量呈正比曲线，因而结果不受影响。

** 一般情况下，标准管、空白管及对照管每批只需做 1～2 只，若样本不存

在溶血、脂血现象，则对照管可以不测，用空白管来代替对照管。

*** 吸取上清比色时最好用移液器吸取上清加入比色皿中，尽量避免倾倒，以免

沉淀进入比色皿，影响吸光度。

注 1 ：用此方法所测各管吸光度值比规范操作方法要高，但不影响最终结果。

注 2 ：5%组织匀浆 a*取 0.1～0.2mL 进行检测较好。

注③：若发现检测样本吸光度太低，可以将水浴时间 40 分钟延长至 80 分钟，

但您的同一课题中 MDA 的检测都必须延长至 80 分钟，以免造成批间

差异。

注④：此方法标准管参考吸光度：当标准品取样量为 0.1mL 时，则标准管吸光

度减去空白管吸光度为 0.103～0.112。当标准品取样量为 0.2mL 时，则

标准管吸光度减去空白管吸光度为 0.206～0.224。

(四)、计算公式及举例：

样本、试剂一为相同量。

** 一般情况下，标准管、空白管及对照管每批只需做 1～2 只，若样本不存在溶血、

脂血现象，则对照管可以不测，用空白管来代替对照管。

*** 吸取上清比色时最好用移液器吸取上清加入比色皿中，尽量避免倾倒，以免

沉淀进入比色皿，影响吸光度。

2、标准管参考吸光度：当标准品取样量为 0.1mL 时，则分光光度计测定标准管

吸光度减去空白管的吸光度为 0.065～0.070（酶标仪测

定取 200μl 读数时为 0.045 左右）。当标准品取样量为

0.2mL 时，则标准管吸光度减去空白管的吸光度为

0.130～0.140（酶标仪测定取 200μl 读数时为 0.1 左右）。

旋涡混匀器混匀，离心管口用保鲜薄膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴（或

用锅开盖煮沸）80 分钟，取出后流水冷却，然后 3500～4000 转/分，离心 10 分钟，

（3000 转/分以下离心时间需延长，目的使沉淀）。取上清***，532nm 处，1cm

光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。

a*为样本取样量，标准品、无水乙醇、样本量均相等，生理盐水的量为样本的两

倍，试剂一的量为样本的四倍。例如高脂血清取 0.1mL，则标准品，无水乙

醇取 0.1mL，生理盐水取 0.2mL，试剂一取 0.4mL。

** 一般情况下，标准管、空白管及对照管每批只需做 1～2 只，若样本不存在溶

血、脂血现象，则对照管可以不测，用空白管来代替对照管。

*** 吸取上清比色时最好用移液器吸取上清加入比色皿中,尽量避免倾倒，以免

沉淀进入比色皿，影响吸光度。

3、标准管参考吸光度：此方法标准管参考吸光度：当标准品取样量为 0.1mL

时，则分光光度计测定标准管吸光度减去空白管的吸

光度为 0.113～0.122。当标准品取样量为 0.2mL 时，

则分光光度计测定标准管吸光度减去空白管的吸光度

为 0.216～0.234。

离心管盖上盖，用针在盖上扎一小孔，旋涡混匀器混匀，95℃水浴（或用锅开

盖煮沸）80 分钟，取出后流水冷却，然后 3500～4000 转/分，离心 10 分钟，（3000

转/分以下离心时间需延长，目的使沉淀）。取上清***，532nm 处，1cm 光径，

蒸馏水调零，测各管吸光度值。

a* 为样本取样量，标准品、无水乙醇、样本量均相等，试剂一的量为样本的

三倍。例如高脂血清取 0.1mL，则标准品、无水乙醇取 0.1mL，试剂一取

0.3mL。

** 一般情况下，标准管、空白管及对照管每批只需做 1～2 只，若样本不存

在溶血、脂血现象，则对照管可以不测，用空白管来代替对照管。

*** 吸取上清比色时最好用移液器吸取上清加入比色皿中，尽量避免倾倒，

以免沉淀进入比色皿，影响吸光度。

2、标准管参考吸光度：此方法标准管参考吸光度：当标准品取样量为 0.1mL

时，则分光光度计测定标准管吸光度减去空白管的吸

光度为 0.114～0.123。当标准品取样量为 0.2mL 时，

则分光光度计测定标准管吸光度减去空白管的吸光度

为 0.216～0.235。

十、红细胞中的 MDA 检测方法

（一）、微量红细胞中的 MDA 检测方法（样本量少时用）

1、样本前处理：（可用以下二种方法中的一种）

（1）、载玻片取全血，进行 MDA 测定：

如果您所需测的血样很少又很珍贵，例如新生儿指血，或小老鼠的尾血，可采

用载玻片上滴加 1～2 滴肝素涂匀，60ºC 以下烤干，或自然吹干。将以上采取的少

量血样滴在有肝素的载玻片上，用微量加样器取您所需的血量，再制备成 1︰99 的

溶血液。（即全血︰蒸馏水=1︰99）

（2）、玻璃微量采血管采集红细胞及溶血液的制备：

①、用 20μl 的玻璃微量采血管取载玻片上的肝素抗凝全血 20μl 左右。将玻璃毛细采

血管置水平位，迅速取下吸球，将空隙长的一端放在酒精灯火焰的三分之一处

烧至透红，管端变成圆球状闭结为止。用尺测量并记录血柱长度 a 厘米。用纸

将采血管卷好，然后将采血管封闭端朝下装入离心管中，1500 转/分离心 5～10

分钟，取出后用小砂轮在血清与红细胞分界处划开掰断（或用剪刀直接剪断）。

将有红细胞的开口端倒放入装有 1mL 蒸馏水的离心管中，再以 1500 转/分离心

5 分钟，此时毛细管中的红细胞沉淀于离心管底部，用镊子从离心管中取出毛

细管丢弃后，将离心管放在混匀器上旋涡混匀制成溶血液。

离心管盖上盖，用针在盖上扎一小孔，旋涡混匀器混匀，95℃水浴（或用锅开

盖煮沸）40 分钟，取出后流水冷却，然后 3500～4000 转/分,离心 10 分钟,（3000 转

/分以下离心时间需延长，目的使沉淀）。取上清***，532nm 处，1cm 光径，蒸

馏水调零，测各管吸光度值。

a* 表示所取的样品量、标准品量、无水乙醇的量、试剂一的量，四者均相等。例如

样品取 0.1mL 则标准品、无水乙醇、试剂一也取 0.1mL，若样品取 0.2mL 则标

准品、无水乙醇及试剂一也取 0.2mL。因吸光度与加样量呈正比曲线，因而结

果不受影响。

** 一般情况下，标准管、空白管及对照管每批只需做 1～2 只，若样本不存在溶

血、脂血现象，则对照管可以不测，用空白管来代替对照管。

*** 吸取上清比色时最好用移液器吸取上清加入比色皿中,尽量避免倾倒,以免沉淀

进入比色皿,影响吸光度。

规范操作方法标准管吸光度：当标准品取样量为 0.1mL 时，则分光光度计测定标准

管吸光度减去空白管的吸光度为 0.065～0.070（酶标仪测定 200μl 读数时为 0.045

左右）。当标准品取样量为 0.2mL时，则标准管吸光度减去空白管的吸光度为0.130～

0.140（酶标仪测定 200μl 读数时为 0.1 左右）。

注：若发现检测样本吸光度太低，可以将水浴时间 40 分钟延长至 80 分钟，但您

的同一课题中 MDA 的检测都必须延长至 80 分钟，以免造成批间差异。

②、方法二:（微量法）（用此方法所测各管吸光度值比规范操作方法所得值要

高，但不影响最终结果。）

先将已经按规范操作方法配好的 MDA3 号试剂用 50％的冰醋酸按 2︰1 稀释，

例如将配好的 MDA3 号试剂 100mL，加 50%的冰醋酸 50mL,混匀。也可以用多少

配多少进行以下检测。

（注：50%冰醋酸的配制是 50mL 蒸馏水加 50mL 冰醋酸混合而成的。）

离心管盖上盖，用针在盖上扎一小孔，旋涡混匀器混匀，95℃水浴（或用锅开

盖煮沸）40 分钟，取出后流水冷却,然后 3500～4000 转/分，离心 10 分钟，（3000 转

/分以下离心时间需延长，目的使沉淀）。取上清***，532nm 处，1cm 光径，蒸

馏水调零，测各管吸光度值。

a* 表示所取的样品量、标准品量、无水乙醇的量、试剂一的量，四者均相等。例如

样品取 0.1mL 则标准品、无水乙醇及试剂一也取 0.1mL，若样品取 0.2mL 则标

准品、无水乙醇及试剂一也取 0.2mL。因吸光度与加样量呈正比曲线，因而结

果不受影响。

** 一般情况下，标准管、空白管及对照管每批只需做 1～2 只，若样本不存在溶血、

脂血现象，则对照管可以不测，用空白管来代替对照管。

*** 吸取上清比色时最好用移液器吸取上清加入比色皿中,尽量避免倾倒，以免沉

淀进入比色皿，影响吸光度。

注：若发现检测样本吸光度太低，可以将水浴时间 40 分钟延长至 80 分钟，但您的

同一课题中 MDA 的检测都必须延长至 80 分钟，以免造成批间差异。

此方法标准管参考吸光度：当标准品取样量为 0.1mL 时，分光光度计测定标准

管吸光度减去空白管的吸光度为 0.103～0.112。当标准品取样量为 0.2mL 时，分

光光度计测定标准管吸光度减去空白管的吸光度为 0.206～0.224。

3、取某浓度的溶血液进行血红蛋白测定：

Hb 测定：取 100 倍浓缩的 Hb 测试液 1mL (本所有货供应)，加水至 100mL 配

成应用测试液，取 1：x 血球溶血液 20μl 加稀释好的 Hb 应用测试液

5mL, 充分混匀，静置 5 分钟，波长 540nm, 1cm 光径，蒸馏水调零，

比色，记录各管吸光度值。Hb 计算：将吸光度值乘以 367.7 即为

Hb 克数/升。如果血样量特少时，则样本量和试剂量均可减少一半

或按比例减少。

4、红细胞中 MDA 的计算：

在旋涡混匀器上混匀 1 分钟使细胞充分溶解。

③、抽提：在上述溶血液中加全血体积 2 倍的无水乙醇（0.3mL），(也可用 95%乙醇

代替)在旋涡混匀器上充分混匀 30 秒钟。

④、沉淀蛋白：再加全血体积 2 倍的三氯-甲烷（0.3mL）置旋涡混匀器上混匀 1 分钟，

然后 3000～3500 转/分，离心 5～10 分钟。此时液体分为三层，上层为 MDA

抽提液，中层为血红蛋白沉淀物，下层为三氯-甲烷。取上清并记录体积，约

0.9mL。

丙二醛（MDA）测试盒（TBA 法）