液体样本甘油酶法测定试剂盒 生化试剂

 液体样本甘油酶法测定试剂盒

描述：甘油是甘油三酯的水解产物。脂蛋白酯酶能够水解血

液中的甘油三酯；胰脂酶可以水解食物中的甘油三酯；激素

敏感脂肪分解酶能够水解脂肪细胞中的甘油三酯。与游离脂

肪酸一样，甘油含量是甘油三酯水解反应的可靠检测指标，

但检测更加方便。本试剂盒采用甘油磷酸氧化酶法与经典的

GPO-Trinder 酶学反应方法，通过比色测定液体样本中的甘

油含量。经过优化后，操作步骤更加简单，检测线性范围在

10-1200µmol/L，可靠性和重复性俱佳，适合生物医学、食

品实验室检测。

原理：在 ATP 存在下甘油被甘油激酶磷酸化为 3-磷酸甘油，

再被甘油磷酸氧化酶氧化产生过氧化氢；在过氧化物酶作用

下生色底物转化为苯醌亚胺，其光密度值与甘油浓度成正

比。

适用范围：测定血液、细胞培养基、体液、酒类饮料中的甘

油浓度。

组成 ：（以 250 次为例）

(1) R1 试剂 40 ml

(2) R2 试剂 10 ml

(3) 4 mmol/L 甘油标准品 1 ml

4 ºC 保存，6 个月有效

所需设备：酶标仪、生化分析仪或 721、722 型可见光分光

光度计。最佳工作波长 550nm，如无此波长建议优先选用

570nm、次选 530、490nm。

一 样本处理：

1. 酒类、饮品、清澈液体样本：可直接进行测定，如超过

线性范围可用蒸馏水或生理盐水稀释后再进行测定。

2. 培养液：取不含酚红、无颜色、无血清的细胞培养基，

如有细胞碎片应 4ºC,，12,000g 离心 5min,取上清进行测

定。

3. 血液：对于新鲜抗凝血而言，可 4ºC，2,000g 离心 5min

得到血浆；而对于非抗凝血来说，可先 4ºC 静置 2h 得

到血清后，2000g 离心 10min,除去血细胞。将得到的血

浆/血清 70ºC 加热 10 分钟灭活內源脂肪酶，12,000g

离心 10min ,去上清进行测定或-20ºC 保存。

二 工作溶液配制：按 4:1 比例，取 4 ml 试剂 R1 与 1 ml 试

剂 R2 混合即可，立即使用或 4ºC 保存<1 天，变色弃去。

三 标准品稀释：用蒸馏水、生理盐水或与样品缓冲液一致

的液体，将 4 mM 甘油标准品倍比稀释为 1000、500、

250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 µmol/L，通常

取其中 4~6 管即可，注意设置 0 浓度对照反应管。

四 甘油浓度测定：

1. 参见下表进行加样。为使反应时间尽量一致，减小实验

误差，可先加入标准品、待测样品，然后再加入工作溶

液。（注意：当甘油浓度较低时，可将待测样品与工作

溶液按照 100µl:100µl 体积进行混合，然后再进行测定，

但是如果样品体积超过 100µl 时将会稀释工作液中酶

的浓度，致使反应灵敏度下降。如果待测样品浓度超过

线性范围的时候，可进行适当稀释，然后根据稀释倍数

来计算样品中甘油浓度。）

2. 37ºC 或 25ºC 反应 15 分钟。反应平衡后颜色在 60 分钟

内稳定。

3. 先用蒸馏水+工作液的空白管调零，然后测定各管 OD

值。

4. 绘制标准曲线并计算甘油浓度。

附 Excel 作图步骤：各标准管 OD 值为 y 轴，标准品浓

度为 x 轴。(1)鼠标左键圈住数据，点击做图向导，选

择-散点图-，点击-完成-。(2)鼠标右键点图上的某一

点，点击-添加趋势线-，点击-选项-，点击-显示公式-

和-R 2值-。

表一：

酶标微板测定的加样比例（检测范围 10-1200µmol/L）

（可对样品和工作液比例进行微量调整）

说明：

1. 维生素C>0.18g/L、血红蛋白>2g/L、胆红素>0.25g/L、二硫

苏糖醇、巯基乙醇、高浓度EDTA干扰测试。

2. 正常血清甘油浓度为20-130µmol/L，细胞培养时须用不含酚

红的无色无血清培养基，如果培养基中含有酚红，可以选择

含有酚红的无细胞培养基作为对照进行测定。

参考文献：

1. Trinder, P. (1969). Ann. Clin. Biochem. 6: 24 – 27.

2. Barham D and Trinder P. (1972). Analyst 97: 142 – 145

 液体样本甘油酶法测定试剂盒