碱性磷酸酶（AKP）测试盒（微量酶标法），分解磷酸苯二钠，产生游离酚和磷酸，酚在碱性溶液中与 4-氨基安替吡啉作用经铁氰-化钾氧化生成红色醌衍生物，根据红色深浅可以测定酶活力的高低。

碱性磷酸酶（AKP）测试盒（微量酶标法）

（微量酶标法）

一、测定原理：

碱性磷酸酶分解磷酸苯二钠，产生游离酚和磷酸，酚在

碱性溶液中与 4-氨基安替吡啉作用经铁氰-化钾氧化生成红色

醌衍生物，根据红色深浅可以测定酶活力的高低。

三、样本采集及保存：

1、按常规采集样本, 样本可以是血清、血浆（肝素抗凝为佳）、

细胞培养上清。组织或培养细胞（按实验方法学进行样本前

处理，然后进行测定）。

2、如样本收集后（如血清（浆）、组织、培养细胞、培养上清等）

不能及时检测，请将样本放置于-20℃以下保存（温度越低越

好）。

七、注意事项：

1、 如果所用的酶标仪没有此波长，可以用相近的 510nm 或

者 530nm 波长均可，且 510nm 波长测定结果相对 530nm

更好。

2、 由于加样量比较少，建议加样时将吸头靠近酶标板底部，

缓慢加样，边加边将吸头上移，以保证吸头上样本残留

量最少，减少加样方面存在的误差。

3、 所加试剂接近于水剂，所以对吸头的黏附性很小，但加

试剂时还是需要注意，速度不宜太快，以免溅出酶标孔

外。

4、 加样或加试剂若靠壁加入则需靠近底部，前部分处理反

应液量比较少，若靠近上端加样则会有部分黏附于酶标

孔上端。

5、 酶标孔比较小，所以混匀力度要适中，太剧烈则可能将

液体溅出，太慢则混匀不充分；先将孔壁上的液体轻轻

的震动落下，再前后、左右的摇动。

6、 一般对于酶标板可能存在初始吸光度的差异，在使

用之前先在相应的波长处测定其初始的吸光度，然后再

加样测定。

7、 本试剂盒仅用于科研、实验室。

8、 正式实验前需要取 2 例预计差异的样本进行预试，

若酶活力过高可将其稀释后测定 OD 值控制在 0.2 或 0.3

左右，若酶活力较低，则直接测定或加大一倍取样量后

测定。

附录Ⅲ： AKP 标准曲线制作

一、样本前处理：

将标准品贮备液用双蒸水 50 倍，20 倍，10 倍，5 倍，2.5

倍，5/3 倍，1.25 倍稀释及原液操作（浓度为 0.022 mg/mL、

0.055 mg/mL、0.11 mg/mL、0.22 mg/mL、0.44 mg/mL、0.66

mg/mL、0.88 mg/mL、1.1 mg/mL）

附录Ⅳ： 培养液及培养细胞中 AKP 测定

一、样本前处理：

1、细胞培养液：吸取培养液，1000-1500 转/分钟，离心 10 分钟，

取上清液进行测定。

2、培养细胞前处理：

①、培养细胞的收集：

悬浮培养细胞：可直接通过离心收集沉淀细胞（1000 转/

分钟，离心 10 分钟，弃上清留沉淀细胞）

贴壁培养的细胞：吸去上清，可通过细胞刮直接将细胞刮

下；或者是用 0.25%的胰-酶室温消化 2～3 分

钟，加培养液终止消化，用微量移液器轻轻

吹打，将所有液体吸出转入 EP 管，然后 1000

转/分钟，离心 10 分钟弃上清，留沉淀细胞，

再加入 1mL PBS 轻轻吹打，再次 1000 转/分

钟，离心 10 分钟弃上清，留沉淀细胞待用。

如暂时不做，则可以将细胞沉淀物低温冻存，

温度越低越好。

②、培养细胞的破碎：

研磨破碎：在细胞沉淀中加入一定量（10 6的细胞一般加

0.3～0.5mL）的缓冲液（缓冲液可以用 PBS

或者是生理盐水），用手动玻璃匀浆器冰水浴

研磨 3～5 分钟，或者是用卡富隆电动研磨器

冰水浴研磨 3 分钟待测；

超声破碎：在细胞沉淀中加入一定量（10 6 的细胞一般加

0.3～0.5mL）的缓冲液（缓冲液可以用 PBS

或者是生理盐水），需保证超声探头在液面以

下。功率 300W，冰水浴，每 3～5S 超声一次，

间隔 4 次（每次间隔时间为 30S 左右）

化学裂解：贴壁培养的细胞，可直接将上清吸去后，直接

在孔板或是瓶中加入一定量的裂解液（覆盖满

细胞），裂解 30～40 分钟（可用显微镜观

察细胞破碎情况），再用微量移液器吸出待测。

根据需要可用生理盐水或 PBS 进行一定的稀

释。

碱性磷酸酶（AKP）测试盒（微量酶标法）