柠檬酸合成酶（CS）测定试剂盒 生化试剂

柠檬酸合成酶（CS）测定试剂盒

（citroyl synthetase Kit）

一、技术背景：

柠檬酸合成酶，即 citroyl synthetase，又称柠檬酸缩合酶，

在三羧酸循环（又称柠檬酸循环）中有非常重要的作用，因

为它催化的反应是关键步骤。而三羧酸循环是需氧生物体内

普遍存在的代谢途径，是三大营养素糖类、脂类、氨基酸代

谢联系的枢纽和最终代谢通路。

三羧酸循环（英语：Tricarboxylic acid cycle；TCA cycle），

或柠檬酸循环（Citric acid cycle）或克雷伯氏循环（Krebs

Cycle），是需氧生物体内普遍存在的代谢途径，因为在这个

循环中几个主要的中间代谢物是含有三个羧基的柠檬酸，因

此得名；或者以发现者汉斯·阿道夫·克雷伯命名为克雷伯氏循

环，简称克氏循环（Krebs cycle）。三羧酸循环是三大营养素

（糖类、脂类、氨基酸）的最终代谢通路，又是糖类、脂类、

氨基酸代谢联系的枢纽。

在三羧酸循环中，反应物葡萄糖或者脂肪酸会变成乙酰

辅酶 A。这种“活化醋酸"（一分子辅酶和一个乙酰基相连），

会在循环中分解生成最终产物二氧化碳并脱氢，质子将传递

给辅酶烟-酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和黄素腺嘌呤（FAD），

使之成为 NADH + H+和 FADH2。NADH + H+和 FADH2 会

继续在呼吸链中被氧化成 NAD+和 FAD，并生成水。这种受

调节的“燃烧"会生成 ATP，提供能量。

真核生物的线粒体和原核生物的细胞质是三羧酸循环的

场所。它是呼吸作用过程中的一步，但在需氧型生物中，它

先于呼吸链发生。厌氧型生物则首先遵循同样的途径分解高

能有机化合物，例如糖酵解，但之后并不进行三羧酸循环，

而是进行不需要氧气参与的发酵过程。

在三酸酸循环第一步反应中，催化乙酰辅酶 A 的乙基与

草酰乙酸的酮基结合生成柠檬酰辅酶 A，以便后续高能硫酸

键水解，释放出辅酶 A，得到柠檬酸。柠檬酸合成酶是一个

调控酶，此酶的底物乙酰辅酶 A 和草酰乙酸是它的激活剂，

NADH、琥珀酰辅酶 A 是抑制剂。

三、所需仪器：

酶标仪（412nm）、微量移液器、漩涡混匀器、高速离心

机、37℃水浴/气浴箱、台式离心机、研钵或高速组织分

散器（匀浆机）、冰、双蒸水、离心管（1.5mL 或 2mL）。

四、试剂组成及配制：（A108-1-1 20T）

㈠、前处理试剂：

提取液 20mL×1 瓶，4℃保存。

冲洗液 50mL×1 瓶，4℃保存。

㈡、反应试剂：

试剂一：缓冲液 4mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：底物液 0.6mL×1 支，-20℃避光保存。

试剂三：显色剂 0.6mL×1 支，-20℃避光保存。

试剂四：阴性对照液：0.2mL×1 支，4℃避光保存。

五、试剂组成及配制：（A108-1-2 50T）

㈠、前处理试剂：

提取液 50mL×1 瓶，4℃保存。

冲洗液 100mL×1 瓶，4℃保存。

㈡、反应试剂：

试剂一：缓冲液 10mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：底物液 1.4mL×1 支，-20℃避光保存。

试剂三：显色剂 1.4mL×1 支，-20℃避光保存。

试剂四：阴性对照液：0.5mL×1 支，4℃避光保存。

六、试剂盒存放：

本．试．剂．盒．收．到．后．按．规．定．条．件．存．放．，．有．效．期．6．个．月．。．

七、友情提醒：

本试剂盒内所有试剂仅限于科学研究使用，不得用于临

床诊断及药物治疗等。

八、操作步骤：

1、样本前处理：

A）方法一：液氮研磨

①、样本准备：取出新鲜组织或冷冻组织（4℃解冻或室

温解冻），用冲洗液冲洗干净，滤纸吸干，准确称取

组织重量 100～300mg,加入液氮，快速用研磨棒碾

碎组织成粉末状，备用。

②、10%待测悬液制备：取研磨后组织粉末称重置于离

心（1.5mL 或 2mL）管中，并按重量(g)：体积(mL)=1：

9 的比例加入 9 倍体积的提取液，涡旋混匀器剧烈

混匀 30 秒，间隔 2 分钟，重复操作 2～3 次，制备

10%待测悬液。放回冰槽环境回温。

③、离心处理：将装有 10%待测悬液的离心管置于 4℃

台式离心机，10000 转/分钟，离心 10 分钟。

④、10%待测上清制备：取出离心管置于冰槽环境，小

心吸取 10%待测上清液转移到新离心管（1.5mL 或

2mL）待测，同时用考马斯亮蓝试剂（或 BCA 试剂）

测定蛋白浓度（本所有售）。

B）方法二：机械匀浆（如不具备液氮操作条件）

①、10%待测悬液制备： 取出新鲜组织或冷冻组织（4℃

解冻或室温解冻）,用冲洗液冲洗干净,滤纸吸干；准

确称取组织重量，按重量（g）：体积(mL)=1:9 的比

例，加入 9 倍体积的提取液，冰水浴条件下机械匀

浆，制备成 10%待测悬液。

②、离心制备 10%待测上清：10000 转/分，离心 10 分钟，

吸取上清即为 10%的待测上清液。同时用考马斯亮

蓝试剂（或 BCA 试剂）测定组织蛋白浓度。

2、操作步骤：

⑴、仪器准备：

将酶标仪设定到待测波长（412nm），预温 30min，

使之各项指标参数处于较稳定使用状态。

⑵、试剂准备：

将冷冻试剂（底物液、显色剂）与冷藏试剂（缓冲

液、阴性对照液）取出，平衡至室温后使用。

⑶、样本准备：

将待测样本置于冰槽回温平衡后待测。

⑷、反应步骤（96 孔板操作）：（附赠 96 孔板 1 块）

a、取干净无菌 96 孔酶标板，置于试验台水平放置

并标记待测样本编号，即 U 孔（或阴性对照孔，

即 O 孔）；

b、加入试剂一（缓冲液）190μL 于 96 孔酶标板 U

孔（或 O 孔）中；

c、加入试剂二（底物液）25μL 于上述 U 孔（或 O

孔）中；

d、加入试剂三（显色剂）25μL 于上述 U 孔（或 O

孔）中；

e、将加入上述试剂 96 孔酶标板轻摇混匀并置于

37℃孵育箱 3～5min；

f、取出装有预温试剂的 96 孔酶标板，水平置于试

验台；

g、加入待测样本 10μL 于上述 U 孔中（或阴性对

照液 10μL 于 O 孔中）（待．测．样．本．须．澄．清．，．冻．存．

后．复．溶．样．本．据．情．况．需．离．心．除．去．析．出．蛋．白．后．再．

用．）；

h、轻摇该酶标板，使待测样本（或阴性对照液）

与预温试剂充分接触；并将该操作 96 孔酶标板

转入酶标仪，波长 412nm，测定待测样本吸光

度 OD 值，记为 AU0（阴性对照孔为 AO0）；

i、将该 96 孔酶标板转入 37℃孵育箱（或者在 37℃

恒温酶标仪）中温浴 15min；

j、再将该操作 96 孔酶标板转入酶标仪，波长

412nm，测定待测样本吸光度 OD 值，记为 AU15

（阴性对照孔为 AO15）；；

k、待测样本值（U 孔）：待测样本吸光度 AU15— 待

测样本吸光度 AU0。

【阴性对照值（O 孔）：AO15-AO0】

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