Annexin V-FITCPI凋亡检测试剂盒的操作说明

保存方式
4℃避光可保存12个月。

操作说明
1. 细胞样品的准备：
a) 悬浮细胞：
1）收集细胞⾄离⼼管中1000-2000rpm离心5min，小心去除上清。
2）用1ml 4℃预冷PBS轻轻重悬细胞并计数，1000-2000rpm离心5min，小心吸除上清。
3）再加⼊1ml 4℃预冷的PBS重悬细胞，1000-2000rpm离心5min，小心吸除上清。
b) 贴壁细胞：
1）吸出细胞培养液至离⼼管中，PBS洗涤贴壁细胞⼀次，加⼊适量不含EDTA的细胞消化液消化细胞。
2）室温孵育⾄轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除细胞消化液。需避免的过度消化。
3）加⼊以上步骤中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离⼼管内，1000-2000rpm离⼼5min，⼩⼼吸除上清。
注：加⼊的细胞培养液一方面可以收集已经悬浮的发⽣凋亡或坏死的细胞，另一方面细胞培养液中的⾎清可以有效抑制或中和残留的；残留的会消化并降解后续加⼊的 Annexin V-FITC 导致染⾊失败。
4）⽤1ml 4℃预冷PBS轻轻重悬细胞并计数，1000-2000rpm离心5min，小心吸除上清。
5）再加⼊1ml 4℃预冷的PBS重悬细胞，1000-2000rpm离心5min，小心吸除上清。

2. ⽤去离⼦⽔按1：4稀释 Binding Buffer（4ml Binding Buffer+12ml去离⼦⽔）；
3. 用 250ul结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1×106/ml；
4. 取100ul的细胞悬液于5 ml流式管中，加入5ul Annexin V-FITC，轻轻混匀；
5. 室温(20-25℃)避光孵育10min；
6. 上机前5min加⼊10ul碘化丙啶溶液，轻轻混匀；
7. 上机前在反应管中补加400ul PBS重悬细胞，避光保存，随即进⾏流式细胞仪（FACS）检测， Annexin V-FITC为绿⾊荧光，PI为红⾊荧光。如使用荧光显微镜，可直接观察。

产品描述
磷脂酰（PS）是⼀种带负电荷的磷脂，正常细胞中，PS只分布在细胞膜脂质双层的内侧，⽽在细胞凋亡早期，细胞膜PS由脂膜内侧翻向细胞膜外侧，使PS暴露在细胞膜外表⾯。Annexin V是⼀种分⼦量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋⽩，与磷脂酰有⾼度亲和⼒，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被*为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之⼀。

本试剂盒将Annexin V进⾏绿⾊荧光（FITC）标记，以标记了的Annexin V作为探针，利⽤荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发⽣。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是⼀种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜⽽使细胞核染红。因此采⽤Annexin V与PI双染的⽅法，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

注意事项：
1. 微量试剂需离⼼数秒将试剂收集⾄管底后再开盖取⽤。
2. Propidium Iodide（PI）、Annexin V-FITC有毒，操作时要带⼿套，使⽤时避免与⽪肤，眼睛和黏膜接触。
3. 本试剂盒⽤于检测活细胞，流式细胞仪检测时，细胞数量不应低于1x106。
4. 染⾊后宜尽快检测，时间过⻓可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。
5. Annixin V检测凋亡细胞的⽅法适⽤于悬浮⽣⻓的细胞，如：淋巴细胞等细胞的检测。对于贴壁⽣⻓的细胞，由于在等消化处理过程中会造成细胞膜的损伤，会造成较⾼的假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团，从而影响检测，可消化后的细胞保存在含2%BSA的PBS中，防⽌进⼀步的损伤。尽管⽬前，包括国外也有⼀些单位采⽤该⽅法检测贴壁⽣⻓的细胞。但不推荐，因为其重复性较差，且需要操作时⾮常⼩⼼。
6. .细胞固定后可能导致荧光的淬灭，请不要固定样品。
7. .如果样品来源于血液，请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS，能与Annexin V结合，从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200g离心洗去血小板。

 Annexin V-FITCPI凋亡检测试剂盒的操作说明