RT-PCR实验外包，mRNA、miRNA、lncRNA、DNA实验代测

服务内容：

1.制定个性化实验方案：根据不同的实验目的确定实验方案、选定合适的内参；
2.检测类别：mRNA、miRNA、lncRNA、DNA；
3.样本抽提及质检：对客户提供样本进行RNA抽提，并利用NanoDrop进行样本质检；
4.定量PCR预实验：包括样本反转录为CDNA、配置PCR反应体系及进行Real-TimePCR反应；
5.正式定量PCR实验：根据预实验结果进行正式实验；
6.数据分析：采用2- △△CT法进行分析，比较不同样本间差异。

服务要求：
1.请提供组织样本，细胞样本，血浆或血清样本，totalRNA；
2.请提供已知的全长基因序列或GeneBank号；
3.请提供尽可能详细的背景资料：DNA/RNA来源、基因丰度等。

结果内容：整理好的报告，样本收到之日起5个工作日内反馈质检结果。

结果展示：

样本质检图

溶解曲线：

扩增曲线

数据统计

每个指标有2张图。一张是扩增曲线，另一张是熔解曲线，用来证明PCR扩增中无非特异性扩增

送样运输要求：

1. 样品处理

a. 动物组织：常规组织，脂肪组织，结缔组织，纤维化组织适当增加。将组织剪切成合适大小后（建议组织块长宽高均不大于0.5 cm），然后迅速浸泡于5～10倍体积的RNAsolidTM试剂中。（注意：已浸入RNAsolidTM试剂中的组织经平衡一段时间后，可从溶液中取出，切成更小的组织块，再重新放回RNAsolidTM试剂中；有些比较弱的液体渗透性组织如骨头等，不适合用RNAsolidTM试剂进行RNA保护。）

b.植物组织：新鲜的叶、果肉、种子最少100 mg。将嫩叶，嫩茎组织切成合适的大小（建议长宽高均不大于0.5 cm）后，然后迅速浸泡于5～10倍体积的RNAsolidTM试剂中。（注意：某些植物组织天生具有的屏障，如叶子表面的蜡层可阻碍RNAsolidTM试剂的渗透，对于此类组织，通常需破坏这些屏障层以允许溶液的浸透。）

c.细胞等样本：收集不小于10^6个细胞的沉淀（用PBS清洗1-2次）。之后迅速加入5～10倍体积的RNAsolidTM试剂。

d.酵母、细菌等样本：离心弃上清，收集小米粒大小的单菌体沉淀，然后迅速加入适量的RNAsolidTM试剂浸没菌体沉淀。

e. RNA样品： OD260/280为1.8-2.0，浓度≥100 ng/μL，体积≥20μL，干冰运输。

f.cDNA：cDNA原液≥20 μL，干冰运输。

2. 样品保存及运输

加入有RNAsolidTM试剂的样本可在37℃保存1～2天，2天以后部分组织中的RNA会开始降解。室温（25℃）稳定保存1周，不会有明显的RNA降解发生。大部分样品置于RNAsolidTM试剂中，4℃条件下可稳定保存1个月，不会有明显的RNA降解发生。长期存放可先将保存在RNAsolidTM试剂中的样本4℃浸透过夜，然后将RNAsolidTM试剂吸出弃去，再将样本放入-20℃或-80℃长期稳定保存3～5年。

关于Real-time qPCR如何进行数据分析

1. Real-time qPCR常见参数

基线（baseline）

通常是3-15个循环的荧光信号

同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线

阈值（threshold）

自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍

手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强

同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。

Ct值:与起始浓度的对数成线性关系。

分析定量时候一般取Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量的不准确。

Rn（Normalized reporter）是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。
△Rn：△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果（△Rn=Rn-基线）。

2. 影响Ct值的关键因素

模板浓度

模板浓度是决定Ct的最主要因素。控制在一个合适范围内，使Ct在15-35之间

反应液成分的影响

任何分子的荧光发射都受环境因素影响----比如溶液的pH值和盐浓度。

PCR反应的效率

PCR反应的效率也会影响Ct值。在PCR扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增，与PCR扩增效率高的条件下相比，可能会所产生斜率不同的标准曲线。PCR效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一般说来，反应效率在90-110%之间都是可以接受的。

3. 如何评估实时定量PCR反应的效果

PCR扩增效率：为了正确地评估PCR扩增效率，至少需要做3次平行重复，至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度。

另一个评估PCR效率的关键参数是相关系数R2，它是说明两个数值之间相关程度的统计学术语。如果R2等于1，那么你可以用Y值（Ct）来准确预测X值（量）。如果R2等于0，你就不能通过Y值来预测X值。R2值大于0.99 时，两个数值之间相关的可信度很好。

标准偏差（standard deviation，偏差的平方根）是的精确度计量方法。

如果许多数据点都靠近平均值，那么标准偏差就小；如果许多数据点都远离平均值，则标准偏差就大。实际上，足够多重复次数产生的数据组会形成大致的正态分布。这经常可通过经典的中心极限理论来证明，独立同分布随机变量在无限多时趋向于正态分布。如果PCR反应效率是 100%，那么2倍稀释点之间的平均Ct间隔应该恰为1个Ct值。要以99.7%的几率分辨2倍稀释浓度，标准偏差就必须小于等于0.167。标准偏差越大，分辨2倍稀释的能力就越低。为了能够在95%以上的情况下分辨出2倍稀释，标准偏差必须小于等于 0.250

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