免疫组化代测之教你完成石蜡切片制作

1.烤片

烤片的目的是将带有蜡的组织切片牢固地黏在载玻片上，以免染色过程中切片脱落。切片在56~60℃的恒温箱中至少放置1小时才能达到此目的，但是，通常的烤片温度为;8～60℃，时间为2~6小时。由于高温干燥可加速组织中抗原的氧化，因此高温烤片对抗原有破坏作用。

2.脱蜡和水化

分别在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡15～30分钟，以脱掉组织中的蜡。但是，进人组织中的二甲苯不能与水溶性染色液相溶，故需进一步通过下行梯度乙醇把组织中的二甲苯逐步替代出来。切片在100%乙醇工、Ⅱ中分别浸泡5分钟，95%、90%、80%和70%乙醇中分别浸泡2分钟，PBS漂洗3次，每次3分钟，置蒸馏水中待用。

3.抗原修复

信帆生物科技公司凭借的生物技术和严格的质量管理体系，专业代做免疫组化实验 ，雄厚的技术力量做基础，专业团队做后盾，对免疫组化 提供100%的率热情的技术服务。  
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4.细胞膜打孔

切片置于0.1%~0.3%TritonX-100中，室温浸泡25分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟。TritonX-100为去污剂，其脂溶性可使细胞膜穿孔，增加细胞膜对抗体的渗透性。检测细胞膜抗原时可免去此步骤。

5.灭活内源性酶及封闭内源性生物素

6.非免疫血清封闭

抗体能被组织切片中富有电荷的胶原和结缔组织成分吸附。从而导致背景着色，为了防止这种现象发生，在特异性抗体处理切片之前，选择与二抗种属相同的非免疫血清封闭电荷，阻止一抗与之结合，抑制非特异性背景着色。常用方法是用2%～10%羊血清或2%～5%牛血清白蛋白在室温下作用10~30分钟。但应注意此种结合不牢固，所以不要冲洗，倾去余液直接加一抗。SABC或SP免疫组织化学试剂盒中常配有非免疫血清。

7.*抗体孵育

滴加特异性一抗于切片上，4℃孵育24～48小时，或室温孵育过夜，也可在37~C孵育1～2小时。之后，用PBS冲洗3次，每次5分钟。一抗分为多克隆抗体和单克隆抗体。多克隆抗体的抗原专一性较差，非特异性反应较明显，效价不太稳定。但多克隆抗体制备简便，价格低廉，抗体效价较高，稀释度一般在1：100～1000之间，高者可达1：数万。

利用单克隆抗体制备技术制备的单克隆抗体特异性强，无交叉反应，质量和效价稳定，非特异性反应较少，标记结果可靠，在应用中有更多的*性。但单克隆抗体制备复杂，价格昂贵，抗体效价较低，稀释度在1：50～100。抗体的选择是开展免疫组化染色zui重要环节之一。市场销售的一抗大部分来源于国外，生物试剂厂家各异，因此，对购入的抗体首先要进行预实验检测。试剂公司在销售抗体时附有说明书，包括抗体的来源、免疫球蛋白的亚类、单抗或多抗、使用稀释度、使用流程和注意事项、洗涤时缓冲液的适宜离子强度和pH值等。市场销售的一抗分为即用型和浓缩型两种，对前者抗体的效价无需摸索，但对于浓缩型一抗，则应摸索出*的工作效价，抗体浓度过高或过低都将可能出现阴性结果，应该以一个适当的稀释度得到*的抗原染色强度和zui低的背景着色。稀释特异性抗体常用含1%～3%非免疫血清的PBS，需现配现用，稀释后的一抗存放时间不可超过三天。

8.生物素标记第二抗体孵育

滴加稀释度合适(按说明书的稀释度或预实验摸索)的生物素标记二抗于切片上，室温孵育1小时，继而PBS漂洗3次，每次5分钟。二抗有抗鼠、抗兔和抗羊等之分，特异性要与一抗匹配，否则，一抗和二抗连接有误可导致假阴性染色结果。例如，兔抗鼠或人的一抗需与抗兔的二抗匹配，小鼠抗大鼠或人的一抗需与抗小鼠的二抗匹配。目前，生物素化二抗多以即用型形式存在于SABC或SP免疫组织化学试剂盒中，故无需考虑其浓度。

9.SABC-POD或SABC-AP孵育

滴加稀释度合适(按说明书的稀释度或预实验摸索)的ABC-POD或SABC-AP于切片上，室温孵育10~30分钟，随后PBS漂洗4次，每次5分钟。SABC或SP试剂盒中的即用型试剂无需稀释。

10.显色

显色是免疫组化染色的zui后关键步骤，一般过氧化物酶的检测系统选用DAB或AEC显色。前者显色为棕色，后者为红色。要得到*的显色效果，必须在镜下严格控制，以检出物达到zui强显色效果而背景五色为终止点。根据经验，DAB在配制后zui长放置时间是30分钟以内，过时则不能使用，DAB滴加到组织切片时作用时间zui长不宜超过10分钟(在5分钟内)，否则不管有无阳性结果均应终止反应。对一些富含内源性酶的组织用DAB显色时极易出现背景色，应尽早在镜下控制，以达到*分辨效果。DAB有致癌作用，故操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触，用后及时洗手，接触DAB的实验用品经洗液浸泡24小时后方能再次使用。AEC显色系统的弊端是易溶于有机溶剂，所以封片时应以水性封片剂为主，故染色切片不能保存。免疫酶染色时，酶底物浓度的增加或孵百盯面雨延长，均可增强染色强度。过氧化物酶显色时，H2O2浓度使显色反应过快而致背景加深，且过量H2O2能抑制酶的活性，故H2O2浓度要适中。

如果上述步骤使用链霉亲和素―生物素―碱性磷酸酶复合物，则需选用NBT/BCIP作为显色系统.阳性结果为蓝黑色。显色后蒸馏水或自来水冲洗。采用碱性磷酸酶作为标记物底物时，染色过程中的缓冲液用0.02mol/LTBS(pH 8.2)较好。

11.苏木精复染细胞核

为使组织切片清晰的显示组织结构，便于准确定位，常对切片进行复染。zui常使用的细胞核染料为苏木精，也可根据情况使用甲基绿和核快红。染色约10秒，镜下控制着色程度，效果好时自来水冲洗返蓝。

12.封片

如果选用DAB显色，则切片经过梯度乙醇脱水(80% 乙醇2分钟，95%乙醇2分钟)，乙醇Ⅰ和100%Ⅰ乙醇Ⅱ各5分钟，二甲苯Ⅰ和Ⅱ各透明5分钟，zui后中性树脂封固;如果选用AEC显色，则切片不能经乙醇脱水，冲洗后拭干直接用水性封片剂封片。