现AR技术已广泛应用于免疫组化(IHC)各领域的研究，例如在诊断病理学和IHC的标准化方面。对原来仅表达在冰冻切片上的抗原，利用AR后绝大部分抗体能用于常规甲醛固定的石蜡切片上，对IHC回顾性研究和病理IHC鉴别诊断，肿瘤患者术后的预后检测及疗效评估具有积极的意义。

一、 AR技术

加热AR技术

微波加热方法. 在传统标准方法,经脱蜡、脱水和用3%H2O2阻断内源性过氧(化)物酶，石蜡切片经蒸馏水冲洗，放置在塑料Coplin缸中。加入AR液，如蒸馏水、缓冲液、金属盐液、尿素等，盖上并置家用微波炉加热5或10分钟(注意防止切片干躁)。有时在加热5分钟后，间隔1分钟，再加热5分钟(在*个5分钟后检测液体高度)。加热后，从微波炉取出塑料Coplin缸，冷却15分钟。片子经蒸馏水冲洗二次后在PBS液中浸5分钟，才进行IHC染色。为了保持一致的加热条件，必须设定靠近微波炉中心相同的位置及同一编号的Coplin缸 ，按照不同的抗体设定不同的加热时间，尽可能的建立标准的加热条件。

微波(MW)加热过程如下：在盒内放入200ml柠檬酸缓冲液(PH6.0±0.1)，并盖上带有小孔的盖子，微波加热至沸腾;将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架中，放入已沸腾缓冲液中，有作者提供做免疫组化时采用微波炉中等功率800W[3]，微波炉选用解冻档的国产家用微波炉(根据目前的研究,建议用医用微波炉)，中档继续处理10-20分钟;取出微波塑料缸冷却至室温，从缓冲液中取出玻片，片子经蒸馏水冲洗二次，之后用PBS(PH7.2-7.4)冲洗两次，每次3分钟。

尽管有少数作者[4]认为经高温后冷却这一步省略。在我们观点，15分钟的冷却必须的几点理由：1、如这一步省略，对于有些抗体而言，会降低AR-IHC染色强度。2、突然从高温到低温可导致组织片掉片。3、可能引起形态学的变化。

单纯加热方法. 将切片放入盛有柠檬酸缓冲液的容器中,置电炉(600W)上加热至沸腾，并持续10min 。Shi等人[2]用单纯加热方法与微波加热方法比较IHC染色强度，显示两种方法导致相同的染色强度。

非加热AR技术

非加热AR技术包括酶消化、酸水解等方法。目前，主要是酶消化，酶消化是以化学的方法来打断醛键，修复抗原。

胰蛋白酶消化法.取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入100ml0.05%或0.1%PH7.8的无水氯化钙水溶液中，溶解即可;或由迈新提供的0.125%的液体胰酶。将切片放入湿盒内37oC温箱中消化18-20分钟。

胃蛋白酶消化法 . 用0.1mol/L HCL配制成0.4%的胃蛋白酶;

链霉蛋白酶消化法 . 将链霉蛋白酶溶于0.5mol/LpH7.4的Tris-HCL中，浓度为o.1%，消化时间20min。

抗原修复的方法选择，关系到组织抗原能否暴露充分，这对免疫组化染色效果有很大影响。因此应当根据不同的抗原特点，采用不同的修复方法。对某些细胞内抗原(如Fas、Bax、FⅧ等)和细胞间质抗原(如Laminin、CoIV等)则需要用酶消化法处理切片。常用的消化酶为胰蛋白酶和胃蛋白酶。一般说来，胰蛋白酶消化能力较胃蛋白酶弱，主要用于细胞内抗原的消化，胃蛋白酶主要用于细胞间抗原的消化。工作中要认真参照抗体说明书指示进行消化酶的选择，这样针对性更强，标记效果更理想。

二、AR应注意的问题

加热持续时间和强度是重要的影响因素之一，AR液的PH值、浓度、化学成分也是重要的影响因素之一。使用低PH值AR液必须使用阴性对照片，以防止定位不准[9]。Shi等人[10]强调修复缓冲液的PH值对某些抗原的修复十分重要,实验中我们也发现要获得满意结果必须选择抗原修复液的zui适PH值。在常规石蜡切片做AR-IHC，采用不同浓度的Alcl3液做AR液，发现4%的Alcl3取得的染色[11]。在修复的抗原中，金属盐可影响蛋白的结构。郑辉等人[12]使用0.01mmol/LPBS、0.01mol/L柠檬酸缓冲液、0.1mol/L Tris-HCL缓冲液及1mmol/L EDTA-Na2，于微波修复抗原，发现其阳性强度逐渐增强。

高温抗原修复因其机理相当复杂，对某些存在的问题很难用设计对照的方法加以解决，有些抗体在冰冻切片上呈阴性反应，但在石蜡切片用抗原修复后却能很好的显示。对某些应表达在胞浆或表达在核内的抗原，经过量修复后，绝大部分表达在核内，例如，P185、Bcl-2、P-gp、Nm23，而有些表达在核内的抗原经过量修复会出现在胞浆内，例如P53、PcNA、Ki-67等[6]。在使用该方法时一定小心，对结果的判断也要客观地作出分析，侯宁等人发现端粒酶逆转录酶(TRT)经过抗原修复与不经过抗原修复，其染色效果明显不同，后者的阳性率明显高于前者[8]。操作中还应注意如下问题：

1、热处理后应注意自然冷却。

2、热处理时要防止切片干燥。

3、应根据不同的抗体选择合适的抗原修复方法。

4、一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致。

5、注意形态学结构的改变(一般经高温修复后胞浆会明显的破坏，而对细胞核的影响，会出现核破裂，苏木素淡染等现象，而经酶水解的切片，其细胞浆破坏视消化时间而异，但核破坏较轻)。

6、如果在常用的缓冲液中无法实现抗原修复，或经修复后抗原定位发生改变，可改用一些不常用的缓冲液，或加一些螯合剂，如EDTA等可改善某些抗原的修复。

三、AR的标准化和发展

抗原修复的确切原理尚不十分清楚，根据国内外文献报道，推测可能是：1、溶解、洗脱变性蛋白。2、水解作用。3、微波场内离子或极性分子直接碰撞的修复作用[7]。抗原修复是否可能?理论上研究尚未清楚，但是以高温、高压、对常规石蜡切片进行抗原修复处理经验表明，可以提高抗原抗体阳性检测率，同时也会出现假阳性。

诊断IHC上的AR技术及其在基础领域的研究已被为数众多的文献和比较多的综述所阐述。此领域的调查目的：从分子生物学诊断常规上，在石蜡组织中检测核酸和蛋白质新途径的可能性，从而形成新兴的分子形态学。一些新的途径必须建立标准化的原则和提高其重复性。[19] 。目前我国病理科大多数医院病理科尚未在IHC、AR上标准化，国外已广泛进行进行AR的标准化及IHC标准化[20]。例如在建立新的修复液方面，针对不同的抗体预定义加热条件和液体浓度、PH值、化学成分，从而推动AR的标准化。

现AR技术已广泛应用于免疫组化(IHC)各领域的研究，例如在诊断病理学和IHC的标准化方面。对原来仅表达在冰冻切片上的抗原，利用AR后绝大部分抗体能用于常规甲醛固定的石蜡切片上，对IHC回顾性研究和病理IHC鉴别诊断，肿瘤患者术后的预后检测及疗效评估具有积极的意义。

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