如何使用光学显微镜

显微镜是研究微生物学的重要工具之一，根据不同的研究目的和要求，可以分别选用普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等，在食品微生物检测中，以普通光学显微镜(简称显微镜)zui为常用。

光学显微镜通常采用两级放大，分别由物镜和目镜完成。被观察物体位于物镜的前方，被物镜做第-一级放大后成，倒立的实像，然后此实像再被目镜做第二级放大成虚像，人眼看到的就是一虚像，而显微镜的总放大倍率就是物镜放大倍率和目镜放大倍率的乘积。

光学显微镜是利用光学原理，把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，以供人们提取微细结构信息的光学仪器。光学显微镜就是利用表面为曲面的光学透镜使物体放大成像这一原理，把微小物体放大到人眼足以观察的尺寸。



放大倍率是指直线尺寸的放大比，而不是面积比。显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率，显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的zui小间距。分辨率和放大倍率是两个不同的但又相互有关联的概念。



当选用的物镜分辨率不够高(数值孔径不够大)时，显微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放大倍率，得到的也只是一个轮廓大但细节不清晰的图像，称为无效放大倍率。反之如果分辨率已经满足要求而放大倍率不足，则显微镜虽已具备分辨能力，但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见。所以为了充分发挥显微镜的分辨能力，应使数值孔径与显微镜总放大倍率合理匹配。



一、显微镜的使用方法

（一)对光

(1)镜检时身体要正对实验台，采取端正的姿态，调整两个目镜之间的距离与观测者瞳距相符，两眼自然睁开，同时左手调节焦距，使物像清晰并移动标本视野，右手记录、绘图。将低倍物镜转至镜筒下方与镜筒成一直线。镜检时载物台不可倾斜，因为当载物台倾斜时，液体或油易流出，既损坏了标本，又污染载物台，也影响检查结果。

(2)利用自然光源镜检时，zui-好用朝北的光源，不宜采用直射阳光；利用人工光源时，用日光灯的光源。转动底部光源或拨动反光镜，调节视野亮度。反光镜有平、凹两面，光源强时用平面，较暗时用凹面，需要强光时，将聚光器提高，光圈放大；需要弱光时，将聚光器降低，或光圈适当缩小。

(3)将待观察的标本置载物台上，载物台上有固定的装置固定标本(见图3)。通过载物台调节旋钮将标本移至镜筒下方。转动粗准焦螺旋使镜筒下降至物镜 镜接近标本。于转动粗准焦螺旋的同时，需俯身在镜旁仔细观察物镜与标本之间的距离。

(4)调节目镜之间距离，双眼分别于左、右目镜中观察，待双眼视野重合，同时左手转动粗准焦螺旋，使镜筒徐徐上升以调节焦距，使视野内的物像看到时即停，再调细准焦螺旋，至标本清晰为止。



(二)物镜的使用

显微镜一般具有三个物镜，即低倍、高倍及油镜，固定于物镜转换盘孔中。观察标本时，使用低倍物镜，此时，视野，标本较易查出，但放大倍数较小(一般放大100倍),较小的物体不易观察其结构。高倍物镜放大的倍数(一般放大400倍),能观察微小的物体或结构。油镜放大倍数可达1000倍，用来观察细菌。



(三)低倍、高倍、油镜头的识别

(1)标明放大倍数10×、40 ×、100 x，或10/0.25、40/0.65、 100/1.30。

(2)低倍镜zui短，高倍镜较长，油镜zui长。

(3)镜头前面的镜孔低倍镜zui大，高倍镜，油镜zui小。

(4)油镜头上常刻有黑色环圈，或“Oil"或“油”字



(四)低倍镜换高倍镜的使用方法

(1)光线对好后，捻转载物台调节旋钮寻找需要观察的标本。

(2)如标本的体积较小，不能清楚查看其构造因而不能确认时，则将标本移至视野中央，再旋转高倍物镜于镜筒下方。

(3)旋转细准焦螺旋至物象清晰为止。

(4)调节聚光器及光圈，使视野内的物象达到zui清晰的程度。



(五)油镜的使用方法

(1)将光线调至zui强程度(聚光器提高，光圈全部开放，亮度调节旋钮或光源放至zui大）。

(2)将标本固定在载物台上，先把低倍镜调至视野zui亮，并找到标本视野的适当位置，然后才能换用油镜。

(3)转动粗准焦螺旋使镜筒上升，滴香柏油1小滴(不要过多，不要涂开)于物镜正下方标本上。

(4)转动物镜转换盘，使油镜头于镜筒下方。

(5)俯身镜旁侧面，在肉眼的观察下，转动粗准焦螺旋使油镜头徐徐下降浸入香柏油内，轻轻接触玻片为止。但勿使两者相碰，防止损伤镜头或玻片。

(6)慢慢转动粗准焦螺旋，使油镜头徐徐上升至见到标本的物象为止。

(7)转动细准焦螺旋，使视野物象达到zui清晰的程度。

(8)左手徐徐移动载物台调节旋钮，并转动细准焦螺旋以观察标本。

(9)标本观察完毕后，转动粗准焦螺旋将镜筒升起，取下标本玻片。立即用擦镜纸将镜头上的香柏油擦净，再用干净的擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭镜头，zui后用干净的擦镜纸将镜头上的二甲苯擦去。注意在擦镜纸擦拭时，要求顺着一个方向旋转擦拭，不能两个方向来回擦。



(六)观察

初学者应先用低倍镜观察，这是因为低倍镜视野的实际范围zui大，易于发现目的物，将标本玻片放在载物台上(注意标本朝上),并使标本位于物镜的正下方，转动粗准焦螺旋，同时从侧面观察，待物镜下降到标本约0.5cm时，开始由目镜观察，同时用粗准焦螺旋升起镜筒，直到出现物象后，改用细准焦螺旋，上下微微转动，仔细调节焦距，直至zui后获得清晰的物象为止。如此时视野里所观察到的部位不理想时，可利用载物台调节旋钮将zui适合的部位移动到视野中央。



由低倍镜转换到高倍镜时，一定要从侧面注视，以防低倍镜未对好焦距而造成镜头与玻片相撞，另外要用手指捏住转换器下面的金属盘使之旋转，而不得用手指捏住物镜来转动，否则使用后，会使光轴歪斜。调节光圈和聚光镜，使亮度适中，再仔细转动细准焦螺旋，调节焦距，获得清晰物象。



细菌或其他标本的细微结构，都需要用油镜观察，由于油镜的工作距离很短(0. 19mm左右),故使用时必须特别小心。在低倍镜找到要观察的部位以后，将镜筒升高，在标本上加一滴香柏油，转换镜头，从侧面注视，用粗准焦螺旋将镜筒小心下降，使油镜浸入油滴，直到几乎与标本接触为止(注意切勿压在标本上，以免压碎玻片，甚至损坏油镜镜头)。从目镜观察，先用粗准焦螺旋徐徐升起(只准上升镜筒，不能向下调节),当视野中有模糊的标本物象时，改用细准焦螺旋调节，直到标本物象清晰为止，如转动粗准焦螺旋已使镜头离开油镜，应重新调节，直至调到看清物象为止。



(七)显微镜的保养

(1)移动显微镜时，右手紧握镜臂，左手稳托镜座，勿倾斜，轻轻取出。不要只用一只手提取，以防显微镜坠落。然后轻轻放在实验台上。注意在任何情况下都不要尝试同时拿起两台显微镜。



(2)显微镜放到实验台上时，先放镜座的一端，再将镜座全部放稳，切不可使镜座全面同时与台面接触，这样会导致震动过大，透镜和细准焦螺旋的装置易损坏。



(3)显微镜须经常保持清洁，勿使油污和灰尘附着。如透镜部分不洁时，用擦镜纸轻擦，如有油污，将擦镜纸蘸少许二甲苯拭去。尤其在使用油镜后。检验目镜是否干净的zui-好方法是在使用显微镜观察时，用拇指和手指旋转目镜，通过镜头上的灰尘是否运动来判断。如果通过清理目镜上方起不到清除灰尘的效果，就应该清理目镜的下方，并用特殊的空气罐工具吹走多余的擦镜纸棉绒。如图4当目镜被拿下清理的时候，应该用擦镜纸遮盖目镜敞开的部分，用特殊的空气喷射装置吹去灰尘和多余的棉绒。



(4)强酸、强碱、酒精、乙醚等都能去漆或损坏机件，需注意不使接触机件。

(5)显微镜不能在阳光下暴晒和使用。

(6)目镜和物镜不要随便抽出和卸下。必须抽取接目镜时，须将镜筒上口用布遮盖，避免灰尘落入镜筒内。

(7)显微镜用完后，取下标本片，经聚光器降下，再将物镜转成“八”字形，转动粗准焦螺旋使镜筒下降，以免物镜与聚光器相碰。然后放入镜箱，或镜外加盖塑料防尘罩。

(8)显微镜应放在干燥的地方，以防生霉。

(9)显微镜是贵重的精密仪器，使用时要加以爱惜，切勿随意拆散玩弄。

二、显微镜的光路

目镜是显微镜顶部一个非常复杂的部件，它由两个或两个以上的内部透镜组成，通常拥有10倍的放大倍数。虽然图2的显微镜示意图给出的是双目显微镜，但是也有单筒目镜的显微镜。另一个重要的部件是物镜，通常显微镜都有可以旋转的镜梁，有利于物镜对玻片的观察。大部分实验室的显微镜物镜的放大倍数通常为:10倍、45倍和100倍，镜头上长标记的英文：low power（低倍），high-dry（高倍）和oil immersion (油镜).有的显微镜可能会有四个镜头，但是zui小的放大倍数只有4倍。





显微镜的第三个重要部件为聚光器，它位于载物台下方，收集由灯(光源)发出的光，射到载玻片。聚光器可以由载物台下方的一个旋钮调节升降。聚光器中有一个光圈可以调节透过光的剂量。如果显微镜缺乏电压来调节光源就主要依靠光圈来调节光源的强度。图1所示的Olympus显微镜的光圈是通过调节一个凸边的圆圈来调节光的强度的。图2显示了显微镜的光路情况。



三、分辨率

显微镜透镜系统的分辨率取决于光圈的数值孔径、光的波长和聚光器的设计。zui0好的显微镜的油镜的分辨率一般在0.2 um.这就意味着两个相距0.2 um的物体用显微镜观察就感觉是两个独立的个体。但是如果相距小于0.2 um,那么两个小物体就被认为是一个物体。想要使显微镜的分辨率得到zui大的发挥，以下因素是必须考虑的：

(1)在光源的上方添加蓝的滤光片，因为短的蓝光波长可以提供更大的分辨率。

(2)聚光器需要放在zui高的位置上，这样可以使光zui大限度的到达目标处。

(3)光圈不能停在靠下的位置。尽管光圈靠下可以提高对比度，但是它会使光圈的数值孔径变小。

(4)油镜需要在载玻片和100倍的目标之间使用。

必须注意的是放大率增大，分辨率必须增大。但是单纯的增加放大率，比如使用20倍目镜是不能增加分辨率的。



四、显微镜的构造



(一)光学部分

1.物镜

该镜头下端接近被检物体，为显微镜上的主要光学装置。由多块透镜组成。一般显微镜具有3个-4个物镜，分成干燥系和油镜两组，干燥系又按放大倍数分为低倍镜和高倍镜。各物镜放大率由其外形辨认，镜头长度越大，镜片口径越小，放大倍数愈大；反之，放大倍数小。油镜头的下缘，一般刻有一圈黑线。此外，各物镜上都刻有放大倍数、孔径数等标志



2.目镜

目镜重要的光学部分之一，和镜检者的眼睛接近。目镜由两块透镜组成，其上刻有倍数。为便于指出物象，常在镜中装黑色细丝一条，作为指针。



3.聚光器

聚光器位于载物台下方的次台上，由数个透镜组成。能上下移动，调节并集聚由光源提供的光线，使集中于载物玻片上。



4.光源

光源提供观察所需光线，装在显微镜的zui下方。



(二)机械部分

1.镜臂

镜臂在镜筒后面，便于显微镜搬移，并作为将镜筒倾斜时的握持部。



2.底座

显微镜的底座用以支持全镜，呈马蹄形。



3.载物台

在物镜下方，呈方形或圆形，用以载放被检物体。中央有孔，可以透光。台上装有一弹簧夹，镜检时可以固定标本片。有的载物台上装有载物台调解旋钮，捻转旋钮，能使标本前后左右移动。



4.光圈

在聚光器下方，可以任意开闭，用以调节射入集光线的多寡。



5.电源和亮度调节旋钮

用于开启光源和调节光源的亮度。



6.粗准焦螺旋和细准焦螺旋

粗准焦螺旋可使载物台距离地升降。细准焦螺旋可以精确地调节距离。