丙酮酸(pyruvic acid PA)检测试剂盒说明书下载
测定意义:
丙酮酸通过乙酰 CoA 连接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代谢,起着重要的枢纽作用。 测定原理: 丙酮酸与 2,4-二硝基苯肼作用,生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙,在碱性溶液中呈樱红色。 需自备的仪器和用品: 可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水。 试剂的组成和配制: 提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存; 试剂一:液体 5mL×1 瓶, 4℃保存; 试剂二:液体 25mL×1 瓶, 4℃保存。 丙酮酸提取: 1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量 (104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提 取液),超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),静置 30min, 8000g,常温离心 10min,取上清待测。 2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织, 加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆,静置 30min,8000g,常温离心 10min,取上清待测。 3、血清(浆)样品:按照血清(浆)体积(mL):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建 议取 0.1mL 血清(浆)加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆,静置 30min, 8000g,常温离心 10min,取上清待测。 测定步骤: 1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 520nm,蒸馏水调零。 2、取 300μL 样本+100μL 试剂一于 1.5mL EP 管中,混匀,静置 2min,加入 500μL 试剂二, 混匀,于 520nm 波长处测定管吸光值 A。 丙酮酸含量计算: 1、标准条件下测定回归方程为 y = 0.0466x + 0.0675; x 为丙酮酸钠含量(μg/mL),y 为吸 光值。 2、按照血清(浆)体积计算 丙酮酸含量(μg/mL)= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(V3×V1÷V2)=214.6×(A-0.0675) 3、按照蛋白浓度计算 丙酮酸含量(μg/mg prot)=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(V1×Cpr)=21.46×(A-0.0675) ÷Cpr 4、按照样品质量计算 丙酮酸含量(μg/g 鲜重)= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(W ×V1÷V2)=21.46×(A-0.0675) ÷W 3、按照细菌或细胞密度计算 丙酮酸含量(μg/104 cell)=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(500×V1÷V2)=0.043×(A-0.0675) V1:加入反应体系中样本体积,0.3mL;V2:加入提取液体积,1 mL;V3:加入血清(浆) 体积,0.1 mL; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数, 500 万。
|