恶性肿瘤对人类的健康有的危害,其发病率呈逐年上升的趋势。肿瘤的生长和转移依赖于新生血管的形成,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在肿瘤新生血管形成中起关键作用。

   因此抑制VEGF的信号转导有可能抑制血管新生,并进一步抑制肿瘤生长。

   本实验预构建可诱导的VEGF的原核表达体系,以大量制备VEGF融合蛋白,为下一步制备VEGF单克隆抗体,及研究其抗肿瘤作用奠定了基础。方法:根据VEGF165cDNA序列和原核表达载体pET-15b多克隆位点序列的特点,设计引物。以大肠癌组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增得到VEGF165全长片段(576bp)。将VEGF165目的基因片段的PCR产物进行低熔点琼脂糖凝胶电泳,采用小量胶回收试剂盒进行回收纯化。将载体质粒pET-15b转化入感受态E.coli DH5α,采用碱裂解法小量抽提载体质粒。以限制性内切酶BamHI及NdeI对目的基因及载体质粒进行双酶切,酶切反应产物分别行低熔点琼脂糖凝胶电泳,回收纯化VEGF165目的基因片段和pET-15b载体片段。将VEGF165目的基因片段和pET-15b载体片段在T4DNA连接酶的作用下连接,构建pET-15b/VEGF165重组表达质粒。用连接反应液转化感受态E.coli DH5α,转化后进行氨苄青霉素筛选,阳性克隆菌落即为含有重组表达质粒的重组工程菌。对重组工程菌进行小量培养,小量抽提重组表达质粒,用BamHI及NdeI进行双酶切鉴定和测序鉴定,以检查重组表达质粒中VEGF165目的基因片段的核苷酸序列是否发生改变以及阅读框架是否正确。鉴定正确的重组表达质粒转化表达型宿主菌BL21 (DE3),筛选后即得到VEGF165特异表达工程菌。挑取工程菌的单克隆菌落,接种于含氨苄青霉素的LB培养基中,37℃振荡培养至菌液OD600=0.4~0.6,加入PITG诱导培养1~8h,收集菌体,加入2×SDS凝胶加样缓冲液,超声破菌,对诱导表达产物分别进行SDS-PAGE和Weestn blot分析。确定表达后对诱导条件进行优化,并确定融合蛋白表达部位。其后大量诱导VEGF165融合蛋白表达,收集、洗涤包涵体,以8mol/L尿素溶解后复性,将复性液经过HisPrep FF 16/10亲和层析柱以亲和层析的方法获得纯化的VEGF165融合蛋白。结果:重组表达质粒pET-15b/VEGF165经特异的双酶切鉴定结果提示,各酶切片段实际大小与理论大小基本一致。测序结果也表明,重组表达质粒中VEGF165目的基因片段的核苷酸序列*正确,阅读框架无误,重组表达质粒构建成功。表达工程菌诱导表达产物的SDS-PAGE分析表明,诱导表达产物中均有相应的VEGF165重组融合蛋白表达,其表达水平较高,并为包涵体表达。进一步的经Western blot鉴定结果显示,VEGF165重组融合蛋白能与VEGF多克隆抗体特异结合,确实为我们要表达的目的蛋白。确定了zui适宜的表达条件为:0.5mmol/L IPTG,37℃,诱导时间4~5h。表达产物经HisPrep FF 16/10亲和层析柱亲和层析可分离纯化得VEGF165融合蛋白。

    结论:本实验成功构建了VEGF165基因的原核表达载体,克隆的VEGF165基因在E.coli BL-21(DE3)中得到了稳定表达,并分离纯化得高纯度的VEGF165重组融合蛋白。pET-15b/VEGF165原核表达载体的构建和诱导表达及分离纯化的成功,为下一步大量制备VEGF165目的蛋白,研制VEGF单克隆抗体,及研究其抗肿瘤作用奠定了基础。