免疫组化染色基本技术及注意事项

1．实验计划

① 根据课题的内容选用动物，选用配套的Ab。如Ab—I鼠抗人的抗体，与其他种属间无 交叉，则不能用其他 动物，而且Ab-Ⅱ必须是羊抗鼠，若PAP法Ab-Ⅲ必须来源于鼠，否则不能连接成复合物。

② 若要比较染色深浅在对照组与实验组间的差异，在贴片方面贴于同一张载片上，否则无可比性。

③ 选用的试剂可靠，货源充足，随时可取。

2．Ab稀释度 （如系购买的药盒有工作液和原液）

（1）工作液：无须稀释

（2）原液：

① 应参照其提供的工作液浓度进行预试验验。

如：工作液浓度为1∶1000， 可选1∶500，1∶1000，1∶1500试验；

若: 1∶500有背景，1∶1000阳性反应稍浅，可选1∶750进行试验。

② 原液的保存（—20℃）冻存——应选稀度冻存。

③ 若工作浓度大于1∶500则要先将原液稀释十倍，而后分装10μl/瓶→冻存（-20 ℃）于 冰箱备用。

④ 关于Ab保存应参照说明书。

（3）Ab浓度的选择

Ab浓度不可太高或太低，因为Ag-Ab结合需在一定浓度范围内进行，若一方过剩则形成复合物小且少；极 过剩时已形成的复合物亦会解体而呈现假阴性。——并非Ab浓度越高越好。

3．Ab滴片技术

—— 所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。

[注意] 滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能干片。

要领：甩净组织周围的水。

4．PBS洗涤技术

（1）洗涤的目的

① 保证离子浓度和PH值。

② 减少非特异反应（平时Ab不可靠很纯）

（2）方法：洗三次，每次5分钟。

5．Ab孵育技术

（1）必须在湿盒内进行，以防抗体的蒸发和干片。

（2）温度与时间 4℃：过夜；

37℃：2 h or 参考说明书

6．光镜控制显色方法

（1）室内操作：注意温度与时间的关系，室温zui宜5分钟。

（2）染色稍浅亦可拿出，脱水，封片后颜色可加深。

对照组和染色结果的评价

从以下几 个方面综合评价：

1．阳性染色特点

① Ag定位，胞浆、胞核、胞膜、间质具有结构性。（非特异性～细胞与组织无区别）

② 染色强度不同：颜色深浅不一（非特异性染色 弥散性均匀）

2．组织切片制作过程的影响

① 固定不良—非特异性染色，显示不均。

② 边缘干燥—非特异性染色（常见），加抗体时勿干片。

3．人工假象与特异性结果显示不在同一平面上。

阳性对照：

用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色。对照切片呈阳性结果，标为阳性对照。

阴性对照：

用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照。其实这只是阴性对照中的一种，阴性对照 还应包括空白、替代、吸收和抑制实验。

▲ 染色失败的几种原因：

（1）所染的全部切片均为阴性结果，包括阳性 对照在内。全部（－）原因可能：

① 染色未*严格按照操作步骤进行；

② 漏加一种抗体，或抗体失效；

③ 缓冲液内含*，抑制了酶的活性；

④ 底物中所加H2O2 量少或失效；

⑤ 复染或脱水剂使用不当

（2）所有切片均呈阳性反应，原因可能是：

① 切片在染色过程中抗体过浓，或干燥了。

② 缓冲液配置中未加氯化钠和PH值不准确，洗涤不*。

③ 使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间过长。

④ 抗体温育的时间过长。

⑤ H2O2 浓度过高，呈色速度过快。粘附剂太厚。

（3）所有切片背景过深，原因可能是：

① 未加酶消化处理切片。

② 切片或涂片过厚。

③ 漂洗不够。

④ 底物呈色反应过久。

⑤ 蛋白质封闭不够或所用血清溶血。

⑥ 使用全血清抗体稀释不够。

（4）阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。

zui常见的原因是：标本的固定和处理不当。

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