果糖磷酸激酶活性测定试剂盒 生化试剂

果糖磷酸激酶活性测定试剂盒

（6-phosphofructokinase，分光光度法 50T/48 样）

一、测定意义

果糖磷酸激酶（PFK）广泛存在于动物、植物、微生物

和培养细胞中，负责将果糖-6-磷酸和ATP转换为果糖-1,6-

二磷酸和ADP，是糖酵解过程的关键调节酶之一。

二、测定原理

PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-1,6-二磷酸和

ADP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化

生成NAD+，在340 nm下测定NADH下降速率，即可反应PFK

活性。

三、自备仪器用品

离心机、紫外分光光度、水浴锅、1mL石英比色皿、移

液枪、研钵、冰和蒸馏水

四、试剂组成和配制

提取液：60mL×1 瓶, 4℃保存

试剂一：40mL×1 瓶，4℃保存

试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存，临用前加2.8mL蒸馏水充

分溶解，用不完的试剂-20℃分装保存不能反复冻融

试剂三：粉剂×1 支，4℃保存，临用前加0.26mL蒸馏水充

分溶解，用不完的试剂-20℃分装保存不能反复冻融

试剂四：液体×1 支，4℃保存，临用前加0.26mL蒸馏水充

分溶解，用不完的试剂-20℃分装保存不能反复冻融

五、样品前处理

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心

后弃上清；按照细菌或细胞数量（10 4个）：提取液体积

（mL）500-1000：1的比例（建议1000万细菌或细胞加

入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率

20％或200W，超声3s，间隔10 秒，重复30 次）；在4°C

下8000g离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)1：5~10 的

比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰

浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测

六、测定步骤

1. 分光光度计预热30min 以上，调节波长到340nm，用蒸馏

水调零。

2. 工作液（可测25个样）的配置：取19mL试剂一和1.26mL

试剂2充分混匀；用不完的试剂4℃保存一周。

3. 将工作也置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）预热

10min。

注意：不同匀浆组织中PFK活性不一样，做正式试验

之前请做1-2只预实验，若△A>0.5，则说明活力太高，

必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液（计算公式

中乘以相应稀释倍数），或缩短反应时间至2min或

5min，使得△A<0.5，以提高检测灵敏度。

七、PFK活性计算

1、血清（浆）活力的计算:

单位的定义：每mL 血清（浆）在每分钟催化1nmol果糖

-6-磷酸和1nmolATP转换为1nmol果糖-1,6-二

磷酸和1nmolADP定义为一个酶活力单位。

PFK(U/mL) = [△A×V反总÷(ε×d)×10 9]÷V ÷T

=450×△A

2、组织、细菌或细胞中PFK活力计算

（1）.按组织蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化1nmol果糖-6-

磷酸和1nmolATP转换为1nmol果糖-1,6-

二磷酸和1nmolADP定义为一个酶活力

单位。

PFK(U/mg) = [△A×V反总÷(ε×d)×10 9]÷(Cpr×V样)÷T

=450×△A÷Cpr

（2）.按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟催化1nmol果糖-6-磷酸和

1nmolATP转换为1nmol果糖-1,6-二磷酸

和1nmolADP定义为一个酶活力单位。

PFK(U/mg) = [△A×V反总÷(ε×d)×10 9]÷(W×V 样÷V样总)÷T

=450×△A÷W

（3）. 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化1nmol果

糖-6-磷酸和1nmolATP转换为1nmol果糖

-1,6-二磷酸和1nmolADP定义为一个酶

活力单位。

PFK(U/mg) = [△A×V反总÷(ε×d)×10 9]÷(1000×V样÷V样总)÷T

=0.45×△A

ε：NADH在340nm 处摩尔吸光系数为6.22×10 3L/mol/cm；

d ：比色皿光径（cm），1cm；

V反总：反应体系总体（L），840μL=8.4×10 -4L；

10 9：1mol=1×10 9nmol；

Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL）

V样：加入反应体系中上清液体积（mL），30μL=0.03mL；

V样总：加入提取液体积，1mL

T：催化反应时间（min），10min。

W，样本质量，（g）

1000： 细菌或细胞总数，1000万。

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