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real-time PCR实验代测

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real-time PCR实验代测

Real-Time PCR 技术,又称实时定量荧光PCR,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,Z后通过标准曲线对未知模板进行总量分析或通过Ct值对模板进行相对定量。

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real-time PCR实验代测

Real-Time PCR 技术,又称实时定量荧光PCR,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,zui后通过标准曲线对未知模板进行总量分析或通过Ct值对模板进行相对定量。

服务说明

荧光定量PCR实验步骤

1、总RNA抽提(枪头和离心管均经过湿热灭菌,无RNA酶)

1)取匀浆器,加入1ml的Trizol Reagent,置冰上预冷。

2)取100mg组织,加入到匀浆器中。

3)充分研磨直至无可见组织块。

4)13000g离心10min取上清。

5)加入250 μl,颠倒离心管15s,充分混匀,静置3min。

6)4℃下13000g离心8min。

7)将上清转移到一新的离心管中,加入0.8倍体积的异丙醇,颠倒混匀。

8)-20℃放置15min。

9)4℃下13000g离心10min,管底的白色沉淀即为RNA。

10)吸除液体,加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。

11)4℃下13000g离心5min。

12)将液体吸除干净,将离心管置于超净台上吹3min。

13)加入20μl无RNA酶的水溶解RNA。

14)55℃孵育5min。

2、反转录(枪头和PCR均经过湿热灭菌,无RNA酶)

1)取一PCR管,加入含2μg RNA的溶液。

2)加入1μl oligo(dT)15。

3)用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。

4)于PCR仪上70℃保温5min,迅速置冰上冷却。

5)依次加入4μl  5×buffer,2μl  10mM dNTPs,1μl RNA inhibitor和1μl 反转录酶,用枪抽吸混匀。

6)于PCR仪上42℃保温60min,结束后80℃保温5min灭活反转录酶。

3、定量PCR

1)取0.2ml PCR管,配制如下反应体系,每个反转录产物配制3管。

2× qPCR Mix  12.5μl

7.5μM基因引物 2.0μl

反转录产物  2.5μl

ddH2O   8.0μl

2)取0.2ml PCR管,配制如下反应体系,每个反转录产物配制3管。

2×qPCR Mix  12.5μl

7.5μM内参引物 2.0μl

反转录产物  2.5μl

ddH2O   8.0μl

3)PCR扩增

预变性    95℃,10min

循环(40次)      95℃,15s→60℃,60s

溶解曲线   75℃→95℃,每20s升温1℃

4、结果处理

ΔΔCT法:

A=CT(目的基因,待测样本)- CT(内标基因,待测样本)

B=CT(目的基因,对照样本)- CT(内标基因,对照样本)

K=A-B

表达倍数=2-K

real-time PCR实验代测

 

注意事项

1、长度:15—30bp。 

2、G十c含量:应在40%一60%之间。

3、碱基分布的随机性

4、引物自身:不要含有自身互补序列,否则会形成发夹样二级结构。

5、引物之间:两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基,不然会形成引物二聚体,尤应避免3’端的互补重叠。

6、上下游引物的互补性:一个引物的3‘末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。

7、3’末端:如果可能的话,每个引物的3‘末端碱基应为G或C。

8、设计RT-PCR的引物时,上下游引物要跨内含子,以消除基因组DNA的干扰。

9、引物设计好后再NCBI上进行序列比对,检查是否可能有错配产物扩增。

10、引物设计要注意种属。

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