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磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)实验代测

  • 型   号:(PEPCK)
  • 价   格:25

节糖异生途径的关键酶。
磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)实验代测

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磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)实验代测

测定意义:PEPCK(EC 4.1.1.32)广泛存在于动物、植物、微生物和细胞中,催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸,是调节糖异生途径的关键酶
测定原理:PEPCK催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO2,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下测定NADH下降速率,即可反映PEPCK活性
自备实验用品及仪器:自备实验用品及仪器: 
分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配置:提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存; 试剂一:液体18 mL×1瓶, 4℃保存;  试剂二:液体16.5uL×1支,4℃保存; 试剂三:粉剂×1支, -20℃保存; 试剂四:粉剂×1支,-20℃保存;
样本前的处理:1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。 2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。 3、血清(浆)样品:直接检测。
测定步骤:1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。 
2、工作液的配制:临用前将试剂二和试剂三转移到试剂一中混合溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。 
3、试剂四的配制:临用前加入1mL蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。 
4、将工作液和试剂四置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热5分钟。 
5、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂四和180μL工作液,立即混匀,记录340nm处初始吸光值A1和 1min后的吸光值A2,计算ΔA=A1-A2。 
注意:在该试剂盒中,若ΔA大于0.1,需将样本用提取液稀释适当倍数后测定,使ΔA小于0.1可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)实验代测

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