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改良Lowry法蛋白定量试剂盒

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改良Lowry法蛋白定量试剂盒兼容性广,RNALOCKER保存的样品可以直接用于RNA提取也可直接用于组织切片、免疫学和流式细胞分析。

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改良Lowry法蛋白定量试剂盒改良 Lowry 法蛋白定量试剂盒1000 次说明书实验步骤
(1)实验开始前将RNA提取液于65水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL80ul,50mL中加入300ul)
(2)
取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀
(3)65水浴3-10 min,期间混匀2-3
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4,5 min)
(5)
取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4,5 min)
(6)
加入1/4V体积10M LiCl溶液,4放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4
离心20min
(8)
弃上清,500ul SSTE溶解沉淀
(9)::异戊醇(25:24:1)抽提两次,异戊醇(24:1)抽提1(10,000rpm,4,5min)
(10)
2V体积的无水乙醇,-70冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4离心20 min
(12)
弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)200ulDEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
改良 Lowry 法蛋白定量试剂盒1000 次说明书注意事项
1) 由于细胞凋亡是一个快速的过程,建议样品在染色后1小时之内进行分析。
2) 对于贴壁细胞,消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞,需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。胰酶消化时间过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤,PI摄入过多;消化时间过长,细胞膜同样易造成损伤,甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-FITC的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后,轻摇时胰酶与细胞充分接触,然后倒掉大部分胰酶,利用剩余的少量胰酶再消化一段时间,待细胞间空隙增大,瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTAEDTA会影响Annexin VPS的结合。
3) 实验中如需要固定细胞,比如在检测凋亡的同时检测细胞周期,只能选用Annexin V-FITC,而不能选用Annexin V-EGFP,因为在固定过程中EGFP会变性导致丧失激发荧光的能力。固定前需要先将细胞与Annexin V-FITC进行孵育,并用binding buffer洗掉未结合的Annexin V-FITC。因为固定过程中细胞通透性增加会产生细胞碎片,可以和Annexin V结合,对结果产生干扰。
4) 如果样品来源于血液,请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS,能与Annexin V结合,从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200 g离心洗去血小板。
5) 试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
6) Annexin V-FITCPI是光敏物质,在操作时请注意避光。

改良Lowry法蛋白定量试剂盒

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