1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)试剂盒

1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)试剂盒

( 货号: A151-1-1 分光光度法 25 管/24 样)

一、测定意义：

二磷酸核酮糖羧化酶(EC 4.1.1.39)是植物光合作用中的一个关键酶，既控制着 CO2的固定，同时又制

约着碳素向 Calvin 循环和光呼吸循环分流，其活性的大小直接影响着光合速率。

二、测定原理：

在 Rubisco 的催化下，1 分子的核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)与 1 分子的 CO2结合，产生 2 分子的 3-磷酸

甘油酸(PGA)，PGA 可通过外加的 3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，产生甘油醛-3-磷酸，

并使还原型辅酶Ⅰ(NADH)氧化。因此，340nm 吸光度的变化可计算还原型辅酶Ⅰ氧化速率，还原型辅酶

Ⅰ氧化速率可反映 Rubisco 的活性。

三、自备的仪器和用品：

可见-紫外分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰、蒸馏水。

四、试剂的组成和配制：

提取液一：液体 25mL×1 瓶，4℃保存；

提取液二：液体 25mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：30mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存，临用前加入 12.5mL 试剂一，充分混匀备用，用不完的试剂分装后-20℃

保存，禁止反复冻融；

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存，临用前加入 12.5mL 试剂一，充分混匀备用，用不完的试剂分装后-20℃

保存，禁止反复冻融；

试剂四：粉剂×1 瓶，-20℃保存，临用前加入 1.25mL 试剂一，充分混匀备用，用不完的试剂分装后-20℃

保存，禁止反复冻融；

（注意：试剂二、三、四溶解后，按需分装-20℃保存。）

五、样本的前处理：

1、总 Rubisco 酶提取：建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，

破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃，8000g 离心 10min，取上清测定。

2、胞浆和叶绿体 Rubisco 酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1:5-10 的比例（建议

称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液一），冰浴匀浆后于 4℃，200g 离心 5min，分离并保留沉淀，取上

清在 4℃，8000g 下离心 10min，取上清用于测定胞浆 Rubisco 酶活性；取沉淀加 1mL 提取液二，震荡

溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃，8000g 离心 10min，取

上清测定叶绿体中 Rubisco 酶活性。

建议测定总 Rubisco 酶活性，按照步骤 1 提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的 Rubisco，则按照

步骤 2 提取粗酶液。（注意：粗酶液制备过程中超声破碎操作使用细胞破碎仪进行。）

六、测定步骤

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预实验

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、样本测定：

（1）工作液的配制：临用前将试剂二和试剂三 1:1 混合，用多少配多少；

（2）在 1mL 石英比色皿中，加入 50μL 样本、50μL 试剂四和 900μL 工作液，立即混匀，记录 340nm 处

20s 时吸光值 A1 和 5min20s 时的吸光值 A2，计算△A=A1-A2。

七、Rubisco 活性计算：

1、按照样本蛋白浓度计算(此法需要测定粗酶液中蛋白质浓度，建议选购本公司生产的 BCA 法蛋白浓度

测定试剂盒)

单位的定义：25℃中 1mg 蛋白 1min 氧化 1nmolNADH 为一个酶活力单位。

Rubisco（nmol/min/mg prot）=[△A×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷（V 样×Cpr）÷T

=643×△A÷Cpr

2、按样本鲜重计算

单位的定义：25℃中 1g 组织 1min 氧化 1nmolNADH 为一个酶活力单位。

Rubisco（nmol/min/g 鲜重）=[△A×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷（V 样÷V 样总×W）÷T

=643×△A÷W

上述计算公式中各符合含义：

V 反总：反应体系总体积，1×10 -3 L；

ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10 3 L/mol/cm；

d：比色皿光径，1cm； V 样：加入样本体积，0.05mL；

V 样总：加入提取液体积 1mL；

T：反应时间，5min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g。

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