羟脯-氨酸(HYP)测定试剂盒在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二甲氨基苯甲醛作用呈现紫红色，根据其呈色的深浅可推算出其含量。

羟脯-氨酸(HYP)测定试剂盒

（碱水解法）

一、测定原理:

羟脯-氨酸在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二甲

氨基苯甲醛作用呈现紫红色，根据其呈色的深浅可推算出

其含量。

二、试剂盒组成与配制：（50 管/48 样）

试剂一：粉剂×1 瓶，甲液 10mL×1 瓶，乙液 20mL×1 瓶，

临用时将粉剂一瓶，先加甲液 10mL 充分溶解（从

瓶口向内看，溶解完）。然后再加乙液 20mL

充分混匀。配好后的试剂 4℃～8℃冰箱保存 3 个

月有效［注］：粉剂加甲液 10mL 后一定要溶

解后才能加乙液。

试剂二：液体 30mL×1 瓶，4℃冰箱避光保存 3 个月有效。

试剂三：粉剂×1 瓶，溶剂 30mL×1 瓶，临用时将粉剂一支

加到 30mL 溶剂中充分溶解，配好后 4℃冰箱避光

保存 1 个月有效。

试剂四：羟脯-氨酸标准品 5mg×3 支，4℃冰箱保存 6 个月。

100µg/mL 标准贮备液的配制：测试前将一支标准品用双

蒸水溶解后定容至 50mL，4℃冰箱保存 2 周。

5µg/mL标准应用液的配制：取100µg/mL标准贮备液1mL

加双蒸水定容至 20mL，现用现配。

样本前处理试剂（4℃保存）：碱水解液 60mL×1 瓶；调 pH

指示剂 5mL×1；瓶；调 pH 甲液 60mL×1 瓶；调 pH

乙液 30mL×1 瓶；活性炭×1 袋。

三、羟脯-氨酸的测定：

（一）、样本前处理：

1、样本水解：

①、血清（浆）：取 0.5mL 血清（浆）准确加水解液 1mL，

混匀。放试管中加盖后，95℃或者沸水浴水解

20 分钟。

②、尿液（培养液）：取 1.0mL 尿液（培养液）准确加水

解液 1mL，混匀。放试管中加盖后，95℃或者

沸水浴水解 20 分钟。

③、组织：精确称取组织湿重 30～100mg 放入试管中，准

确加水解液 1mL，混匀。加盖后 95℃或者沸

水浴水解 20 分钟（水解 10 分钟时混匀一次，

目的是使水解更充分）。

2、调 pH 值至 6.0～6.8 左右。

①、将各试管流水冷却后各管加指示剂 10μL，摇匀；

②、各管准确加入调 pH 甲液 1.0mL，混匀（此时溶液应为

红色）；

③、用 200μL 的加样器吸取调 pH 乙液向各管内逐滴小心

加入调 pH 乙液，每滴加入后均要混匀*，直至液体中

指示剂的颜色变成黄绿色**（亦即红色消失时）。此时

pH 值在 6.0～6.8 左右（约加入调 pH 乙液 100μL～

500μL 左右）；

* 加调 pH 乙液时，每加一滴均要混匀，为防止液体外溢，

如果没有带盖的玻璃磨口试管，可用普通玻璃试管代

替，每次混匀时可用塑料薄膜或冰箱保鲜膜压住试管

口，充分旋涡混匀即可。

**若您的样本是细胞培养液，因其中含有酚红，所以液体

中的混合指示剂在 pH 为 6.0～6.8 左右时为橙黄红色，

而不是黄绿色。

④、然后加双蒸水至 10mL，混匀；

⑤、取 3～4mL 稀释的水解液加适量活性炭（约 20～30mg

左右，以上清液离心后澄清无色为准），混匀，3500

转/分离心 10 分钟，小心取上清 1mL 作检测。

注 1：样本碱水解法的参考取样量：皮肤组织湿重 0.03～

0.05g，软骨湿重 0.08～0.1g，肝组织湿重 0.08～0.1g，

细胞培养液 0.5mL，血清（浆）0.5mL。

注 2：加水解液及调 pH 值甲液一定都要准确，否则较难调

PH 值。

注 3：样本称重时，一定要很精确，以免影响测定结果。先

将组织在保鲜薄膜上剪成湿重约 10mg 左右的块状后

再连同保鲜薄膜一起称重，称完后将样本放进试管中，

再将保鲜薄膜称重，计算出组织净重量。

注 4：如果您的样本量少，则可以从取样、水解、调 pH

均按比例减少，不影响结果。

注 5：每次混匀时可用塑料薄膜或冰箱保鲜膜压住试管口，

充分旋涡混匀，以免混匀过程中液体外溅。

注 6：95℃或者沸水浴时可以用带盖的玻璃磨口试管，也

可用普通玻璃试管代替，用保鲜薄膜封口扎紧，用

针头刺一小孔即可。我们建议用普通玻璃试管比带

盖的玻璃磨口试管更安全。

五、测定意义：

羟脯-氨酸在胶原蛋白中占 13.4%，在弹性蛋白中占极少

量，其它蛋白中均不存在。而胶原蛋白大多分布在皮肤、

腱、软骨、血管等处，因此羟脯-氨酸的量能反映结缔组织

疾病的胶原代谢情况。

有人把皮肤中羟脯-氨酸的测定作为筛选抗衰老药物的

一个指标。在发育阶段随年龄的增长，其羟脯-氨酸在尿中

排泄增加，而发育停止后稳定。老年人的羟脯-氨酸比年轻

人要少。

鼠患有自发性高血压及继发性高血压时，尿中羟脯-氨酸

含量增加。

手术创伤会导致尿羟脯-氨酸排泄量的增加，因高脂、低

蛋白、酒精中毒及毒物、营养不良，或肝细胞变性坏死，

通过炎症使纤维增加，分割肝小叶，导致肝硬化。肝纤维

化时，肝内主要增加的成分为胶原纤维，羟脯-氨酸为胶原

纤维所特-有，测定肝羟脯-氨酸的含量，可换算成肝胶原蛋

白的含量，以反映肝纤维化程度。胶原纤维分解主要依赖

胶原酶和其它蛋白酶的作用，其分解产物羟脯-氨酸从尿中

排出，测定尿羟脯-氨酸的含量，可反应胶原降解的情况。

通过测定组织及尿中羟脯-氨酸的含量，一方面可以判断纤

维化程度，同时可以筛选预防与治疗的药物。

羟脯-氨酸(HYP)测定试剂盒