苹果酸脱氢酶（MDH）-测定试剂盒 生化试剂

苹果酸脱氢酶（MDH）-测定试剂盒

（测组织 紫外法）

二、测定原理：

苹果酸脱氢酶（Malate Dehydrogenase, MDH）催化的氧化还原反应伴随着 340nm 处吸光度的降低，通过测定每分钟吸光度的变化来计算苹果酸脱氢酶的活力。

三、测定意义：

MDH 与植物代谢的多条重要途径有密切关系，它在运转物质和能量的 Mal/OAA（苹果酸/ 草酰乙酸）和 Mal/Asp（苹果酸/天冬氨酸）穿梭中起重要作用；在光呼吸中，MDH 为 Gly 氧化提供 NAD+；在线粒体中，MDH 还是决定 TCA 运转速度的调节酶之一；在细胞溶质中，MDH 与丙酮酸支路相联系。所以 MDH系统不仅是研究酶区域化和酶调节的好系统，也为研究各细胞器之间的联系和许多发育问题提供了方便。根据近几年文献报道，该酶不仅与植物病理有关，还与抗冻，抗盐有关。MDH 与抗热的关系仅见于对嗜热菌的报道。

四、操作步骤：

1、10%匀浆液的制备：准确称取组织重量，按重量(g):体积(mL)=1:9 的比例加入 9 倍体积的生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆,2500 转/分,离心 10 分钟，取上清液进行测定（具体参照实验方法学）根据各种组织中 MDH 活力的不同再用生理盐水按不同的比例将 10％的匀浆上清液稀释成0.2％,0.1%等不同的浓度待测

2、参考取样浓度：肝脏匀浆一般为 0.2％；肌肉匀浆一般为 0.5％

3、操作过程：

a、将紫外分光光度计于 340nm 处,0.5cm 光径石英比色皿,以双蒸水调零 (石英比色皿准备两只,一只用于调零,一只用于测定)。

b、将工作液，37℃预温 3 分钟以上。

c、往相应编号的试管中加入 50μL 待测样本，取 1mL 工作液迅速冲入试管中，立即混匀并计时。(空白管取50μL 双蒸水,加入 1mL 工作液,其它操作与测定相同)

d、迅速倒入石英比色皿中在紫外分光光度计 340nm 处比色，20 秒时读取吸光度值（A1 值）,在 1 分 20 秒时再次测定吸光度值（A2值）；

e、求出 2 次吸光度差值（△A=A1-A2）。

[注]：空白管只须做 1～2 只 (空白 OD 很稳定)；若△A 测定/分钟＜0.05 则需加大样本的浓度；否则影响检测结果；若△A 测定/分钟＞0.3，则需将样本的浓度稀释后再测；否则影响检测结果。

请在批量检测前一定要取正常对照组样本做此样本最佳浓度的预试

附录Ⅰ:小鼠肝组织匀浆反应曲线

1、样本来源：取小鼠新鲜肝脏，用生理盐水制成 10%的匀浆液再用生理盐稀释成 0.2%待测。

2、操作过程：

a、将紫外分光光度计于 340nm 处,0.5cm 光径石英比色皿,以双蒸水调零 (石英比色皿准备两只,一只用于调零,一只用于测定)。

b、将工作液，37℃预温 3 分钟以上。

c、往相应编号的试管中加入 50μL 待测样本，取 1mL 工作液迅速冲入试管中，立即混匀并计时。(空白管取50μL 双蒸水,加入 1mL 工作液,其它操作与测定相同)

d、迅速倒入石英比色皿中在紫外分光光度计 340nm 处比色，20 秒时读取吸光度值（A1 值）,在 1 分 20 秒时再次测定吸光度值（A2值）；

e、求出 2 次吸光度差值（△A=A1-A2）。

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