测定意义： LOX广泛存在于植物组织中，催化不饱和脂肪酸氧化反应，导致膜脂过氧化。在植物的生长发育、成熟衰老及逆境胁迫过程中具有重要作用。 测定原理： LOX催化亚油酸氧化，氧化产物在234nm处有特征吸收峰；测定234nm吸光度增加速率，来计算LOX活性。 自备仪器和用品： 研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪和蒸馏水。 试剂组成和配制： 试剂一：液体×1瓶，4℃保存。 试剂二：液体×1瓶，4℃保存。 试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入2mL试剂二，充分溶解。 粗酶液提取： 称取约0.1g样品，加试剂一1mL，冰上充分研磨，16000g 4℃离心20min，取上清液待测。 测定： 1. 分光光度计预热30 min以上，调节波长到234 nm，蒸馏水调零。 2. 试剂二在25℃水浴中预热30 min以上。 3. 空白管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL蒸馏水、160μL试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后于234nm比色，记录15s和75s的吸光值，分别记为A1和A2。 4. 测定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、160μL试剂二和20μL试剂三，迅速混匀后于234nm比色，记录15s和75s的吸光值，分别记为A3和A4。 LOX活性计算： a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 （1）按蛋白浓度计算 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟催化吸光值变化0.001个单位为1U。 LOX (U/mg prot) = [(A4－A3)－(A2－A1)]×V反总÷(Cpr×V样)÷T×1000= 10 000×[(A4－A3)－(A2－A1)]÷Cpr （2）按样本鲜重计算 活性单位定义：25℃中每克样品每分钟催化吸光值变化0.001个单位为1U。 LOX (U/g 鲜重) = [(A4－A3)－(A2－A1)]×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T×1000= 10 000×[(A4－A3)－(A2－A1)]÷W Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，需另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10-4L；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；W ：样品质量；V样总：上清液总体积，1mL；T：反应时间。 b.使用96孔板测定的计算公式如下 （1）按蛋白浓度计算 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟催化吸光值变化0.001个单位为1U。 LOX (U/mg prot) = [(A4－A3)－(A2－A1)]×V反总÷(Cpr×V样)÷T×1000= 10 000×[(A4－A3)－(A2－A1)]÷Cpr （2）按样本鲜重计算 活性单位定义：25℃中每克样品每分钟催化吸光值变化0.001个单位为1U。 LOX (U/g 鲜重) = [(A4－A3)－(A2－A1)]×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T×1000= 10 000×[(A4－A3)－(A2－A1)]÷W Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，需另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10-4L；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；W ：样品质量；V样总：上清液总体积，1mL；T：反应时间。 注意事项： 1．试剂三易自发氧化，从而导致空白管测定值偏高，必须临用前配制。 2．样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日完成酶活性测定。 |
