测定意义： LPL（lipoprotein lipase）存在于肝外组织毛细血管内皮细胞表面，催化血浆中乳糜微粒(CM)和极低密度脂蛋白(VLDL)中甘油三酯(TG)的水解，在CM及VLDL的降解中发挥重要作用。HL（hepatic lipase）仅存在于肝内皮细胞表面，在中密度脂蛋白(IDL)和高密度脂蛋白(HDL)代谢中起重要作用。LPL 和HL活性降低，可引起高甘油三酯血症。在高脂血症、动脉粥样硬化的发病机理及脂蛋白代谢研究中，常常需要测定LPL及HL活性。 测定原理： LPL和HL均能水解乳剂中TG，生成游离脂肪酸；进一步通过铜试剂法测定体系中游离脂肪酸的生成。 自备仪器和用品： 研钵、冰、台式离心机、微量注射器、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪、肝素钠、氯坊（三氯钾烷）、无水乙醇和蒸馏水。 试剂组成和配制： 试剂一：液体×1瓶，4℃保存。 试剂二：液体×1瓶，室温保存。 试剂三：自备。实验前1 d，在10 mL试剂瓶中加入4.8 mL正庚烷，0.2 mL无水钾醇，5 mL氯坊（自备），盖紧后混匀，室温保存。 试剂四：液体×1瓶，室温保存。 试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前向试剂瓶中加入5 mL无水乙醇，充分溶解。 标准品：粉剂×1瓶，室温保存。临用前向试剂瓶中加入7.8 mL氯坊充分溶解，即为500μmol/L的棕榈酸标准溶液。 粗酶液提取： 1、血液中LPL与HL活性测定：按动物体重，150U/kg肝素钠溶液静脉注射，20min后取血液，即下表中粗酶液，待测。 2、组织中LPL与HL活性测定：组织用生理盐水冲洗干净后，用吸水纸吸取表面水分，称取约0.1 g样品，加入1 mL生理盐水，冰浴匀浆，8000rpm，4℃离心10min，取上清液，即粗酶液，待测。 LPL和HL测定操作： 1. 分光光度计预热30 min以上，调节波长到550 nm，蒸馏水调零。 2. 空白管：取带盖 玻璃试管，加入2 μL蒸馏水，100μL试剂三，40 μL试剂四，40μL试剂五，盖紧后充分震荡混匀（2min），倒入微量石英比色皿/96孔板，静置15min，于550nm光吸收，记为A空白管。 3. 标准管：取带盖 玻璃试管，加入2 μL标准液，100μL试剂三，40 μL试剂四，40μL试剂五，盖紧后充分震荡混匀（2min），倒入微量石英比色皿/96孔板，静置15min，于550nm光吸收，记为A标准管。 4. 总脂酶测定管：取带盖玻璃试管，加入10 μL粗酶液，100μL蒸馏水，100μL试剂二，盖紧后混匀；37℃水浴准确保温60min；吸取2μL上述溶液，加入另一个0.5mL EP管，加入100μL试剂三，40 μL试剂四，40μL试剂五，盖紧后充分震荡混匀（2min），倒入微量石英比色皿/96孔板，静置15min，于550nm光吸收，记为A总脂酶管。 5. 肝脂酶测定管：取带盖玻璃试管，加入10 μL粗酶液，100μL试剂一，100μL试剂二，盖紧后混匀；37℃水浴准确保温60min；吸取2μL上述溶液，加入另一个0.5mL EP管，加入100μL试剂三，40 μL试剂四，40μL试剂五，盖紧后充分震荡混匀（2min），倒入微量石英比色皿/96孔板，静置15min，于550nm光吸收，记为A肝脂酶管。 LPL和HL活性计算： a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 1.血液中LPL与HL活性计算 活性单位定义：37℃中每毫升血清（浆）每分钟在反应系统中所产生的 1 μ mol FFA。 总脂酶活性（U/mL）=[ C标准液÷(A总脂酶管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×V反总÷(V样÷V样总)÷T =0.7×(A总脂酶管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) 肝脂酶（HL）活性（U/mL）=0.7×(A肝脂酶管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) 脂蛋白脂酶（LPL）活性（U/mL）=总脂酶活性－HL C标准液：标准品浓度，500 μmol/L=0.5 μmol/mL；V反总：催化反应体系总体积，10+100+100=210μL=0.21 mL；V样：加入催化反应体系中粗酶液体积，10μL；V样总：粗酶液总体积，1mL=1000μL；T：催化反应时间，15 min。 2. 组织中LPL与HL活性计算 （1）按蛋白浓度计算 37℃中每毫克蛋白每分钟内催化产生1μmol FFA。 总脂酶活性（U/mg pr） =[ C标准液÷(A总脂酶管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×V反总÷(Cpr×V样)÷T =0.7×(A总脂酶管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷Cpr 肝脂酶（HL）活性（U/mL） =0.7×(A肝脂酶管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷Cpr 脂蛋白脂酶（LPL）活性（U/mL）=总脂酶活性－HL （2）按样本鲜重计算 37℃中每克样品每分钟内催化产生1μmol FFA。 总脂酶活性（U/g 鲜重） =[ C标准液÷(A总脂酶管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T =0.7×(A总脂酶管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷W 肝脂酶（HL）活性（U/mL）=0.7×(A肝脂酶管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷W 脂蛋白脂酶（LPL）活性（U/mL）=总脂酶活性－HL C标准液：标准品浓度，500 μmol/L=0.5 μmol/mL；V反总：催化反应体系总体积，10+100+100=210μL=0.21 mL；V样：加入催化反应体系中粗酶液体积，50μL=0.05 mL；V样总：提取液体积，1 mL；Cpr：粗酶液蛋白质浓度，mg/mL；T：催化反应时间，15 min。 b.使用96孔板测定的计算公式如下 1.血液中LPL与HL活性计算 活性单位定义：37℃中每毫升血清（浆）每分钟在反应系统中所产生的 1 μmol FFA。 总脂酶活性（U/mL）=[ C标准液÷(A总脂酶管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×V反总÷(V样÷V样总)÷T =0.7×(A总脂酶管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) 肝脂酶（HL）活性（U/mL）=0.7×(A肝脂酶管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) 脂蛋白脂酶（LPL）活性（U/mL）=总脂酶活性－HL C标准液：标准品浓度，500 μmol/L=0.5 μmol/mL；V反总：催化反应体系总体积，10+100+100=210μL=0.21 mL；V样：加入催化反应体系中粗酶液体积，10μL；V样总：粗酶液总体积，1mL=1000μL；T：催化反应时间，15 min。 2. 组织中LPL与HL活性计算 （1）按蛋白浓度计算 37℃中每毫克蛋白每分钟内催化产生1μmol FFA。 总脂酶活性（U/mg pr） =[ C标准液÷(A总脂酶管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×V反总÷(Cpr×V样)÷T =0.7×(A总脂酶管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷Cpr 肝脂酶（HL）活性（U/mL） =0.7×(A肝脂酶管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷Cpr 脂蛋白脂酶（LPL）活性（U/mL）=总脂酶活性－HL （2）按样本鲜重计算 37℃中每克样品每分钟内催化产生1μmol FFA。 总脂酶活性（U/g 鲜重） =[ C标准液÷(A总脂酶管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T =0.7×(A总脂酶管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷W 肝脂酶（HL）活性（U/mL）=0.7×(A肝脂酶管－A空白管)÷(A标准管－A空白管) ÷W 脂蛋白脂酶（LPL）活性（U/mL）=总脂酶活性－HL C标准液：标准品浓度，500 μmol/L=0.5 μmol/mL；V反总：催化反应体系总体积，10+100+100=210μL=0.21 mL；V样：加入催化反应体系中粗酶液体积，50μL=0.05 mL；V样总：提取液体积，1 mL；Cpr：粗酶液蛋白质浓度，mg/mL；T：催化反应时间，15 min。 |
