测定意义: PDC主要存在于酵母中,是乙醇发酵的关键酶之一,催化丙酮酸脱羧生成乙醛。 测定原理: PDC催化丙酮酸脱羧生成乙醛,添加乙醇脱氢酶(ADH)来进一步催化 NADH还原乙醛生成乙醇和NAD+;NADH在340 nm有吸收峰,而NAD+没有;通过测定340 nm光吸收下降速率,来计算PDC活性。 自备仪器和用品: 研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪和蒸馏水。 试剂组成和配制: 试剂一:液体×1瓶,4℃保存。 试剂二:液体×1瓶,4℃保存。 试剂三:液体×1瓶,4℃保存。 试剂四:液体×1瓶,﹣20℃保存。 混合试剂:临用前配制,小心把试剂四转移到试剂三中,充分溶解。 试剂六:液体×1管,4℃保存。 粗酶液提取: 称取约0.1g样品,加试剂一1 mL,冰上充分研磨,16000g 4℃离心20min,取上清液,待测。 PDC测定操作: 1. 分光光度计预热30min以上,调节波长到340 nm,蒸馏水调零。 2. 试剂二置于25℃水浴中预热30min以上。 3. 空白管:依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL蒸馏水、20μL混合试剂、140μL试剂二和20μL试剂六,迅速混匀后于340nm比色,记录15s和75s的吸光值,分别记为A1和A2。 4. 测定管:依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、20μL混合试剂、140μL试剂二和20μL试剂六,迅速混匀后于340nm比色,记录15s和75s的吸光值,分别记为A3和A4。 PDC活性计算: a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 (1)按蛋白浓度计算 活性单位定义:25℃中,每毫克蛋白每分钟催化1μmol NADH 氧化为1U。 PDC (U/mg prot) ={[(A3-A4)-(A1-A2)]÷(ε×d)×V总×106}÷(Cpr×V样) ÷T =1.61×[(A3-A4)-(A1-A2)]÷Cpr (2)按样本鲜重计算 活性单位定义:25℃中,每克样品每分钟催化1μmol NADH 氧化为1U。 PDC (U/g 鲜重) ={[(A3-A4)-(A1-A2)]÷(ε×d)×V总×106}÷(V样÷V样总×W) ÷T =1.61×[(A3-A4)-(A1-A2)]÷W ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V总:反应体系总体积,0.2mL=2×10-4 L,V样:加入反应体系中上清液体积,0.02mL;V样总:提取液体积,1 mL;Cpr:蛋白浓度(mg/mL),需要另外测定,建议使用本公司BCA蛋白质含量试剂盒;W :样品质量; T:反应时间,1 min。 b.使用96孔板测定的计算公式如下 (1)按蛋白浓度计算 活性单位定义:25℃中,每毫克蛋白每分钟催化1μmol NADH 氧化为1U。 PDC (U/mg prot) ={[(A3-A4)-(A1-A2)]÷(ε×d)×V总×106}÷(Cpr×V样) ÷T =3.22×[(A3-A4)-(A1-A2)]÷Cpr (2)按样本鲜重计算 活性单位定义:25℃中,每克样品每分钟催化1μmol NADH 氧化为1U。 PDC (U/g 鲜重) ={[(A3-A4)-(A1-A2)]÷(ε×d)×V总×106}÷(V样÷V样总×W) ÷T =3.22×[(A3-A4)-(A1-A2)]÷W ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:96孔板光径,0.5 cm;V总:反应体系总体积,0.2mL=2×10-4 L,V样:加入反应体系中上清液体积,0.02mL;V样总:提取液体积,1 mL;Cpr:蛋白浓度(mg/mL),需要另外测定,建议使用本公司BCA蛋白质含量试剂盒;W :样品质量; T:反应时间,1 min。 |