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丙酮酸脱羧酶(PDC)活性测定试剂盒

点击次数:956 发布时间:2019/11/19
提 供 商: 上海信帆生物科技有限公司 资料大小:
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测定意义:

PDC主要存在于酵母中,是乙醇发酵的关键酶之一,催化丙酮酸脱羧生成乙醛。

测定原理:

PDC催化丙酮酸脱羧生成乙醛,添加乙醇脱氢酶(ADH)来进一步催化 NADH还原乙醛生成乙醇和NAD+NADH340 nm有吸收峰,而NAD+没有;通过测定340 nm光吸收下降速率,来计算PDC活性。

自备仪器和用品:

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一:液体×1瓶,4保存。

试剂二:液体×1瓶,4保存。

试剂三:液体×1瓶,4保存。

试剂四:液体×1瓶,﹣20保存。

混合试剂:临用前配制,小心把试剂四转移到试剂三中,充分溶解。

试剂六:液体×1管,4保存。

粗酶液提取:

称取约0.1g样品,加试剂一1 mL,冰上充分研磨,16000g 4离心20min,取上清液,待测。

PDC测定操作:

1. 分光光度计预热30min以上,调节波长到340 nm,蒸馏水调零。

2. 试剂二置于25水浴中预热30min以上。

3. 空白管:依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL蒸馏水、20μL混合试剂、140μL试剂二和20μL试剂六,迅速混匀后于340nm比色,记录15s75s的吸光值,分别记为A1A2

4. 测定管:依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、20μL混合试剂、140μL试剂二和20μL试剂六,迅速混匀后于340nm比色,记录15s75s的吸光值,分别记为A3A4

PDC活性计算:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1)按蛋白浓度计算

活性单位定义:25中,每毫克蛋白每分钟催化1μmol NADH 氧化为1U

PDC (U/mg prot) ={[(A3A4)(A1-A2)]÷(ε×d)×V×106}÷(Cpr×V) ÷T

=1.61×[(A3A4)(A1-A2)]÷Cpr

2按样本鲜重计算

活性单位定义:25中,每克样品每分钟催化1μmol NADH 氧化为1U

PDC (U/g 鲜重) ={[(A3A4)(A1-A2)]÷(ε×d)×V×106(V÷V样总×W) ÷T

=1.61×[(A3A4)(A1-A2)]÷W

εNADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cmd:比色皿光径,1cmV总:反应体系总体积,0.2mL=2×10-4 LV样:加入反应体系中上清液体积,0.02mLV样总:提取液体积,1 mLCpr:蛋白浓度(mg/mL),需要另外测定,建议使用本公司BCA蛋白质含量试剂盒;W 样品质量; T:反应时间,1 min

b.使用96孔板测定的计算公式如下

1)按蛋白浓度计算

活性单位定义:25中,每毫克蛋白每分钟催化1μmol NADH 氧化为1U

PDC (U/mg prot) ={[(A3A4)(A1-A2)]÷(ε×d)×V×106}÷(Cpr×V) ÷T

=3.22×[(A3A4)(A1-A2)]÷Cpr

2按样本鲜重计算

活性单位定义:25中,每克样品每分钟催化1μmol NADH 氧化为1U

PDC (U/g 鲜重) ={[(A3A4)(A1-A2)]÷(ε×d)×V×106(V÷V样总×W) ÷T

=3.22×[(A3A4)(A1-A2)]÷W

εNADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cmd96孔板光径,0.5 cmV总:反应体系总体积,0.2mL=2×10-4 LV样:加入反应体系中上清液体积,0.02mLV样总:提取液体积,1 mLCpr:蛋白浓度(mg/mL),需要另外测定,建议使用本公司BCA蛋白质含量试剂盒;W 样品质量; T:反应时间,1 min

 

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