测定意义： LPS又称甘油酯水解酶，催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油（或者甘油二酯和单酯）。LPS广泛的存在于各种生物中。血清中LPS的异常增高常见于胰腺炎和胰腺癌。 测定原理： LPS催化油酯水解成脂肪酸，利用铜皂法测定脂肪酸生成速率，即可计算LPS活性。 自备仪器和用品： 研钵、台式离心机、震荡混匀器、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪、甲苯、无水乙醇、冰和蒸馏水。 试剂组成和配制： 试剂一：液体×2瓶，4℃保存。 试剂二：液体×1瓶，室温保存。 试剂三：液体×1瓶，4℃保存。 标准品×1瓶，10 µmol/mL的标准溶液，室温保存。临用前加入3.168 mL无水乙醇，充分溶解。 粗酶液提取： 称取约0.1g样品，加试剂一1 mL充分研磨，16000rpm 4℃离心40min，取上清液待测。 LPS测定操作： - 分光光度计预热30 min以上，调节波长到710 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂一和试剂二置于37℃水浴预热30min以上。 3. 空白管：取1.5 mL EP管，依次加入150μL试剂一和50μL试剂二，反复震荡混匀；加入5μL蒸馏水，迅速震荡混匀后置于37℃水浴准确反应10 min；加入400μL甲苯，反复震荡混匀后，室温4000rpm离心10min；取出离心管，小心吸取上层溶液200μL，加入另一1.5mL EP管，再加入50μL试剂三，反复震荡混匀；室温4000rpm离心10min，小心吸取上层溶液150μL，加入微量石英比色皿/96孔板，于710nm处测定吸光值。记为A空白管。 4. 标准管：取1.5 mL EP管，依次加入150μL试剂一和50μL试剂二，反复震荡混匀；加入5μL标准品，迅速震荡混匀后置于37℃水浴准确反应10min；加入400μL甲苯，反复震荡混匀后，室温4000rpm离心10min；取出离心管，小心吸取上层溶液200μL，加入另一1.5mL EP管，再加入50μL试剂三，反复震荡混匀；室温4000rpm离心10min，小心吸取上层溶液150μL，加入微量石英比色皿/96孔板，于710nm处测定吸光值。记为A标准管。 5. 测定管：取1.5mL EP管，依次加入150μL试剂一和50μL试剂二，反复震荡混匀；加入5μL上清液，迅速震荡混匀后置于37℃水浴准确反应10min；加入400μL甲苯，反复震荡混匀后，室温4000rpm离心10min；取出离心管，小心吸取上层溶液200μL，加入另一1.5mL EP管，再加入50 μL试剂三，反复震荡混匀；室温4000rpm离心10 min，小心吸取上层溶液150 μL，加入微量石英比色皿/96孔板，于710nm处测定吸光值。记为A测定管。 LPS活性计算： a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 （1）按蛋白浓度计算 活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸。 LPS (U/mg prot) =[V反总×C标准品×V标准品×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]÷（Cpr×V样÷V样总) ÷T=0.1×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)÷Cpr （2）按样本鲜重计算 活性单位定义：37℃中每克样品每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸。 LPS (U/g 鲜重) =[ V反总×C标准品×V标准品×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]÷(V样÷V样总×W) ÷T=0.1×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)÷W C标准品：10 µmol/mL；V标准品：加入反应体系中标准品体积，0.005 mL；V反总：反应体系总体积，205μL=2.05×10-4L；V样总：上清液总体积，1 mL；V样：加入反应体系中上清液体积，0.005 mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL，需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；T：催化反应时间，10 min。 b.使用96孔板测定的计算公式如下 （1）按蛋白浓度计算 活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸。 LPS (U/mg prot) =[V反总×C标准品×V标准品×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]÷（Cpr×V样÷V样总) ÷T=0.1×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)÷Cpr （2）按样本鲜重计算 活性单位定义：37℃中每克样品每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸。 LPS (U/g 鲜重) =[ V反总×C标准品×V标准品×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)]÷(V样÷V样总×W) ÷T=0.1×(A测定管－A空白管)÷(A标准管－A空白管)÷W C标准品：10 µmol/mL；V标准品：加入反应体系中标准品体积，0.005 mL；V反总：反应体系总体积，205μL=2.05×10-4L；V样总：上清液总体积，1 mL；V样：加入反应体系中上清液体积，0.005 mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL，需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；T：催化反应时间，10 min。 注意事项： 1、甲苯有毒，实验过程中需佩戴手套和口罩。 2、实验过程中须远离火源。 |
