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elisa试剂盒的操作要点

更新时间:2024-04-17   点击次数:141次
elisa试剂盒的操作要点
 
 elisa试剂盒操作步骤包括样本的采集和保存、试剂和样本的平衡、加样、温育、洗涤、显色、比色、结果判定和结果报告。环节众多,任一环节操作不当,皆可影响测定结果。因此,必须重视各环节操作,掌握控制要点,方能保证检测结果准确可靠
样本的采集和保存  
作为激素和治疗药物测定的样本应考虑采集时间及体位等因素影响,可-的松和促甲状腺激素清晨会有一峰值出现;生长激素、促黄体激素、促卵泡激素均以阵发性方式排放;从卧位变为站位时,肾素活性将明显增高;药物浓度监测应根据药代动力学选择合适时间采集样本。
内源性干扰因素对检测结果的影响,如类风湿因子、补体、异嗜性抗体、自身抗体、鼠抗体诊疗所致抗鼠Ig抗体、溶-菌酶等。可以通过稀释、加热、改变固相和酶标抗体、使用鸡抗体IgY以及理化方法去除干扰因子。
外源性干扰因素对检测结果的影响,溶血、脂血、细菌污染、血液标本收缩不充分、存贮过久、反复融冻等。尽量使用玻璃试管抽血,慎用塑料试管盛血,因聚乙烯易吸附抗原和抗体,影响检测结果。
2日内测定血液样本,,置2℃—8℃冰箱保存;2日至7日内测定,置2℃—8℃冰箱保存;7日以上测定,置-20℃以下冰箱保存。
试剂和样本的平衡   
试剂和样本在测定前应先放置室温(20℃—25℃)平衡20分钟以上,以保证后续操作步骤中抗原抗体足够反应温度。
加样本及试剂   
应正确使用移液器和试剂滴瓶。移液器应定期校准和维护,加样本时,应加在微孔下1/3处,不可擦划底部、冲起泡、加到微孔上缘或溅出。滴加试剂(包括抗原、酶结合物及显色剂)时,应摇匀试剂,先弃去瓶口1—2滴,然后垂直、均匀加入微孔。
温育  
温育是ELISA操作中的关键步骤。国产试剂通常采用37℃30分钟和37℃60分钟两种方式。为保证温度均一,抗原抗体反应充分,宜采用水浴方式加热。如用孵箱,可内置一方盘,底衬纱布,加入适量水,微孔板放入其中温育。
洗涤 

ELISA为异相固态方式检测,所以分离结合和游离酶结合物是一个重要环节,洗涤即是达到这样一个目的。洗板质量直接影响检测结果,所以需重视洗板质量。现在新推出的洗板机大多增设有两点吸液、底部冲洗和振荡等功能,可以充分保证洗板质量。手工洗板时,应严格按照试剂说明书操作,洗涤不足和洗涤过度都将影响检测结果。

显色   

ELISA显色常用TMB和H2O2作为显色剂,显色时间37℃15—20分钟,显色过程可不避光。使用前应检查显色剂是否变质,严格控制显色时间。显色剂质量检查,在玻片、试管或eppendorf管中滴入显色剂A和B各一滴,若不变色,则质量可靠。继续滴入一滴酶结合物,摇匀后几分钟内溶液出现蓝色,既可检查显色剂质量,又可检查酶结合物质量。
比色   
加终止液终止显色反应后,通常要求30分钟内用酶标仪完成比色测定。采用主波长450nm测定,可有效避免微孔上的划痕、指印及其它附着物对光的干扰。另外,加终止液后,应尽快比色,因为呈色深的微孔易出现沉淀致吸光度下降明显。
结果判断和结果报告   
判断结果时,要正确按照试剂盒要求设置计算参数,内外对照值均应在控,才能判定测定结果有效。对于少见模式和临界值附近结果应坚持复核


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