过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒
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过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒,分解 H2O2 的反应可通过加入钼酸铵而迅速中止,剩余的 H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物,在 405nm 处测定其变化量,可计算出 CAT的活力。
过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒
(钼酸铵法)
一、测定原理:
过氧化氢酶(Catalase)分解 H2O2 的反应可通过加入
钼酸铵而迅速中止,剩余的 H2O2与钼酸铵作用产生一种淡
黄色的络合物,在 405nm 处测定其变化量,可计算出 CAT
的活力。
二、试剂组成与配制:(100 管/96 样)
试剂一:液体 100mL×1 瓶,4℃保存 6 个月。
试剂二:底物液体 10mL×1 瓶,4℃保存 6 个月。
试剂三:显色粉剂×1 瓶,4℃保存 6 个月。加双蒸水 100mL
溶解,4℃保存 1 个月。(如果底部有不溶粉末沉
淀,直接取上清使用,不影响测定结果)
试剂四:液体 10mL×1 瓶,4℃保存 6 个月。天冷时会凝固,
临用前 37℃加热至透明方可使用。
(二)、组织样本的检测:
1、组织匀浆液的制备:准确称取组织重量,按重量(g):体
积(mL)=1:9 的比例加入 9 倍体积的生理盐水,冰水浴条件
下,制备成 10%的组织匀浆,2500 转/分离心 10 分钟,取上
清,再用生理盐水稀释成取样浓度,待测(取样浓
度摸索见附录)。
注:一般情况下样本没有高脂(浑浊、不透明)、颜色
等导致显著差异情况,对照管的样本可随机取样,做 1~
2 管对照即可。如需做样本自身对照,则试剂盒所测定
样本数量减至 48 样。
3、组织中 CAT 活力的计算:
(1)、定义:每毫克组织蛋白每秒钟分解 1µmol 的 H2O2
为一个活力单位。
注:271 为斜率的倒数,常数,直接使用;V 样:取样量,
0.05mL;T:反应时间,60 秒;Cpr:匀浆液蛋白浓
度,mgprot/mL(prot 指蛋白)。
(三)、全血的检测:
1、1﹕99 溶血液的制备:取 50µL 全血加双蒸水至 5mL 充
分混匀后放置 10 分钟,待测。
注:全血样本测定时必须每个样本都要做自身对照管,空白
对照管只需做 1 管。
3、血红蛋白中 CAT 活力的计算:
(1)、定义:每毫克血红蛋白每秒钟分解 1µmol 的 H2O2
为一个活力单位。
四、注意事项:
1、本试剂盒也可用酶标仪读数(即在反应完后取 200μL 反
应液加入孔板(注意避免气泡产生),405nm 处读数,
计算公式斜率倒数变为 235.65 代入计算);
2、植物样本在测定时,一般不需要稀释来摸索浓度(因
为植物中 CAT 活力较低),可直接取样测定(或加大样本
量测定),计算时也可不测蛋白浓度,改用质量浓度(植
物质量(g)/提取液总体积(mL))代替蛋白浓度代入计
算即可;
3、测定时,加入试剂二的同时需要计时,反应到 60 秒时
必须加入试剂三以终止反应;
4、细胞样本做法也可参照组织样本,前处理可参考本公
司“技术支持"中“技术文章"。
附录Ⅰ:取样浓度摸索
一、样本来源:正常小鼠肝组织
二、前处理:
10%匀浆液的制备:准确称取组织重量,按重量(g)
:
体积(mL)=1:9 的比例,加入 9 倍体积的生理盐水,冰
水浴条件下机械匀浆,制成 10%的组织匀浆,2500 转/
分,离心 10 分钟,取上清液待测;10%的匀浆液再用生
理盐水稀释成不同的浓度: 5%、2%、1%、0.5%、0.25%、
0.125%
过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒