免疫沉淀实验代测

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免疫沉淀实验代测

 免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP），是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体（免疫球蛋白）的FC片段的现象开发出来的方法。

服务说明

1. 细胞培养（贴壁细胞：100mm细胞培养皿中单层细胞长满80％-90％或者细胞培养瓶中细胞达到2-5×10⁷个，悬浮细胞：离心收集细胞，细胞达到2-5×10⁷个）；
2. 加1ml（800uL）冰冷的 IP细胞裂解液到细胞培养皿中【IP裂解液中加入蛋白酶抑制剂（1:50）和PMSF（1:100），如果蛋白磷酸化水平影响实验结果则应加入磷酸酶抑制剂（1:100），注意抑制剂要现加现用】4℃裂解细胞10min，再用移液器反复吹打贴壁细胞，然后将细胞悬浮液转移到15ml离心管中；
3. 用1ml(400uL)冰冷的IP细胞裂解液【IP裂解液中加入蛋白酶抑制剂（1:50）和PMSF（1:100），如果蛋白磷酸化水平影响实验结果则应加入磷酸酶抑制剂（1:100），注意抑制剂要现加现用】洗涤细胞培养皿，将残留裂解细胞转入15ml离心管中；
4. 10000g、4℃离心细胞裂解悬浮液10min，将上清转入新的15ml离心管中，冰上操作，然后测定蛋白浓度（取少量细胞裂解液变性后用于WB检测目的蛋白）；

选做：A.向细胞裂解液上清中加入1.0μg IgG（与IP及COIP实验一抗种属来源相同的普通IgG）和20μL A/G-珠子（使用前充分混匀），4℃摇转孵育30min；

1.       ℃离心细胞裂解液5min，将上清转入一个新的15ml离心管中，冰上操作，然后测定蛋白浓度（取少量细胞裂解液上清变性后用于WB检测目的蛋白）；
2.  

5.  取以上细胞裂解液上清1ml（或者100-500μg细胞总蛋白）到1.5ml离心管中，加入1-10μL（0.2-2μg）一抗（同时加相同量的与一抗种属来源相同的普通IgG作为阴性对照），然后4℃孵育1h；（一般加入1.0μg一抗，具体一抗加入量根据IP级抗体使用说明书进行稀释）

6.  再加入20μL A/G-珠子（使用前充分混匀），用手指轻轻弹匀，4℃摇转孵育过夜；

7.  4℃ 1000g离心5min，小心吸去上清，注意不要吸到底部的珠子，收集免疫沉淀复合物；

8.  将免疫沉淀复合物用1ml冰冷的IP裂解液（不用加各种抑制剂）洗涤4次，每次4℃ 1000g离心5min，每次洗涤小心弃去上清；

9.  zui后一次洗涤之后，小心弃去上清后，加入40μL 1×SDS含巯基乙醇的上样缓冲液，沸水煮10min（除去Agrose-proteinA/G同时将一抗变成重链分子55KD和轻链分子25KD）后4℃1000g离心5min取上清；

10. 取20μL上清样品用于WB检测（选择不同种属的抗体分别进行免疫沉淀实验和WB实验，这样再选择一个种属交叉反应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行WB实验，可以大大减弱抗体分子的重链和轻链分子的WB信号。）

免疫沉淀实验代测

实验材料：1.Agrose-proteinA/G：Santa  货号：SC-2003

2.IP细胞裂解液配方：

Tris-HCl(PH7.4,50mM)         6.055g

NaCl（150mM）              8.766g

0.25％脱氧胆酸               2.5g

1％ NP40                    10ml

EDTA(1mM)                  0.29225g

加纯水定容至1L。

IP实验代测

注意事项

 1.细胞样品量要达到2-5×10⁷个，裂解细胞要使用温和型裂解液-IP裂解液，裂解完后不要加含巯基乙醇的上样缓冲液变性，经免疫沉淀后再变性；

 2.IP及COIP实验抗体使用量依据目的蛋白浓度确定，用量应该使目的蛋白*沉淀，一般按照IP级抗体使用说明进行稀释（抗体使用单抗来避免污染，多抗也可以做，效果没有单抗好），一般加入1μg；

 3.对于IP及 COIP实验的目的蛋白（实验zui后进行WB检测的蛋白）分子量在25KD和55KD左右的，可能会被干扰（解决方案就是选择不同种属的抗体分别进行免疫沉淀实验和WB实验或者使用交联剂将抗体与A/G-珠子交联，然后添加不含巯基乙醇的上样缓冲液处理目的蛋白-抗体-A/G-珠子复合物后，去除抗体-A/G-珠子复合物，上清中只含有目的蛋白）。