COIP实验代测

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COIP实验代测

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法，属于免疫沉淀技术的一类，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。

服务说明

1. 细胞培养（贴壁细胞：100mm细胞培养皿中单层细胞长满80％-90％或者细胞培养瓶中细胞达到2-5×10⁷个，悬浮细胞：离心收集细胞，细胞达到2-5×10⁷个）；
2. 加1ml（800uL）冰冷的 IP细胞裂解液到细胞培养皿中【IP裂解液中加入蛋白酶抑制剂（1:50）和PMSF（1:100），如果蛋白磷酸化水平影响实验结果则应加入磷酸酶抑制剂（1:100），注意抑制剂要现加现用】4℃裂解细胞10min，再用移液器反复吹打贴壁细胞，然后将细胞悬浮液转移到15ml离心管中；
3. 用1ml(400uL)冰冷的IP细胞裂解液【IP裂解液中加入蛋白酶抑制剂（1:50）和PMSF（1:100），如果蛋白磷酸化水平影响实验结果则应加入磷酸酶抑制剂（1:100），注意抑制剂要现加现用】洗涤细胞培养皿，将残留裂解细胞转入15ml离心管中；
4. 10000g、4℃离心细胞裂解悬浮液10min，将上清转入新的15ml离心管中，冰上操作，然后测定蛋白浓度（取少量细胞裂解液变性后用于WB检测目的蛋白）；

选做：A.向细胞裂解液上清中加入1.0μg IgG（与IP及COIP实验一抗种属来源相同的普通IgG）和20μL A/G-珠子（使用前充分混匀），4℃摇转孵育30min；

1.       ℃离心细胞裂解液5min，将上清转入一个新的15ml离心管中，冰上操作，然后测定蛋白浓度（取少量细胞裂解液上清变性后用于WB检测目的蛋白）；
2.  

5.  取以上细胞裂解液上清1ml（或者100-500μg细胞总蛋白）到1.5ml离心管中，加入1-10μL（0.2-2μg）一抗（同时加相同量的与一抗种属来源相同的普通IgG作为阴性对照），然后4℃孵育1h；（一般加入1.0μg一抗，具体一抗加入量根据IP级抗体使用说明书进行稀释）

6.  再加入20μL A/G-珠子（使用前充分混匀），用手指轻轻弹匀，4℃摇转孵育过夜；

7.  4℃ 1000g离心5min，小心吸去上清，注意不要吸到底部的珠子，收集免疫沉淀复合物；

8.  将免疫沉淀复合物用1ml冰冷的IP裂解液（不用加各种抑制剂）洗涤4次，每次4℃ 1000g离心5min，每次洗涤小心弃去上清；

9.  zui后一次洗涤之后，小心弃去上清后，加入40μL 1×SDS含巯基乙醇的上样缓冲液，沸水煮10min（除去Agrose-proteinA/G同时将一抗变成重链分子55KD和轻链分子25KD）后4℃1000g离心5min取上清；

10. 取20μL上清样品用于WB检测（选择不同种属的抗体分别进行免疫沉淀实验和WB实验，这样再选择一个种属交叉反应比较弱或者无种属交叉反应的二抗进行WB实验，可以大大减弱抗体分子的重链和轻链分子的WB信号。）

实验材料：1.Agrose-proteinA/G：Santa  货号：SC-2003

2.IP细胞裂解液配方：

Tris-HCl(PH7.4,50mM)         6.055g

NaCl（150mM）              8.766g

0.25％脱氧胆酸               2.5g

1％ NP40                    10ml

EDTA(1mM)                  0.29225g

加纯水定容至1L。

COIP实验代测

注意事项

1. 免疫共沉淀是建立在蛋白复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋白组分很可能检测不到；

2. 由于蛋白质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使用某一种pull-down抗体，无论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到一半的目标蛋白复合物沉淀出来，如有必要使用多种不同抗体分别进行CoIP；

3. 由于检测的是天然状态，因此在不同的时间和不同的处理下，CoIP拉下来的蛋白复合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋白复合物成员也会越来越庞大；

4. 如果使用Western Blot的方法检测的蛋白复合物中的目标蛋白，则需要在试验前进行预测，具有一定的冒险性；当然如果将蛋白复合物直接进行质谱分析就不存在上述问题，但需要得到较高纯度和浓度的蛋白复合物样品也非易事，并且成本较高；

5. CoIP鉴定得到的蛋白间相互作用可能是直接作用也可能是间接作用，进一步区分还需要进行GST-Pull down等实验检测；

6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使用复合物的不同成员分别独立进行CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使用复合物的任一成员进行CoIP都会得到其他所有成员