羟脯-氨酸(HYP)测定试剂盒 生化试剂

羟脯-氨酸(HYP)测定试剂盒

（碱水解法）

一、测定原理:

羟脯-氨酸在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二甲

氨基苯甲醛作用呈现紫红色，根据其呈色的深浅可推算出

其含量。

二、试剂盒组成与配制：（50 管/48 样）

试剂一：粉剂×1 瓶，甲液 10mL×1 瓶，乙液 20mL×1 瓶，

临用时将粉剂一瓶，先加甲液 10mL 充分溶解（从

瓶口向内看，溶解完）。然后再加乙液 20mL

充分混匀。配好后的试剂 4℃～8℃冰箱保存 3 个

月有效［注］：粉剂加甲液 10mL 后一定要溶

解后才能加乙液。

试剂二：液体 30mL×1 瓶，4℃冰箱避光保存 3 个月有效。

试剂三：粉剂×1 瓶，溶剂 30mL×1 瓶，临用时将粉剂一支

加到 30mL 溶剂中充分溶解，配好后 4℃冰箱避光

保存 1 个月有效。

试剂四：羟脯-氨酸标准品 5mg×3 支，4℃冰箱保存 6 个月。

100µg/mL 标准贮备液的配制：测试前将一支标准品用双

蒸水溶解后定容至 50mL，4℃冰箱保存 2 周。

5µg/mL标准应用液的配制：取100µg/mL标准贮备液1mL

加双蒸水定容至 20mL，现用现配。

样本前处理试剂（4℃保存）：碱水解液 60mL×1 瓶；调 pH

指示剂 5mL×1；瓶；调 pH 甲液 60mL×1 瓶；调 pH

乙液 30mL×1 瓶；活性炭×1 袋。

三、羟脯-氨酸的测定：

（一）、样本前处理：

1、样本水解：

①、血清（浆）：取 0.5mL 血清（浆）准确加水解液 1mL，

混匀。放试管中加盖后，95℃或者沸水浴水解

20 分钟。

②、尿液（培养液）：取 1.0mL 尿液（培养液）准确加水

解液 1mL，混匀。放试管中加盖后，95℃或者

沸水浴水解 20 分钟。

③、组织：精确称取组织湿重 30～100mg 放入试管中，准

确加水解液 1mL，混匀。加盖后 95℃或者沸

水浴水解 20 分钟（水解 10 分钟时混匀一次，

目的是使水解更充分）。

2、调 pH 值至 6.0～6.8 左右。

①、将各试管流水冷却后各管加指示剂 10μL，摇匀；

②、各管准确加入调 pH 甲液 1.0mL，混匀（此时溶液应为

红色）；

③、用 200μL 的加样器吸取调 pH 乙液向各管内逐滴小心

加入调 pH 乙液，每滴加入后均要混匀*，直至液体中

指示剂的颜色变成黄绿色**（亦即红色消失时）。此时

pH 值在 6.0～6.8 左右（约加入调 pH 乙液 100μL～

500μL 左右）；

* 加调 pH 乙液时，每加一滴均要混匀，为防止液体外溢，

如果没有带盖的玻璃磨口试管，可用普通玻璃试管代

替，每次混匀时可用塑料薄膜或冰箱保鲜膜压住试管

口，充分旋涡混匀即可。

**若您的样本是细胞培养液，因其中含有酚红，所以液体

中的混合指示剂在 pH 为 6.0～6.8 左右时为橙黄红色，

而不是黄绿色。

④、然后加双蒸水至 10mL，混匀；

⑤、取 3～4mL 稀释的水解液加适量活性炭（约 20～30mg

左右，以上清液离心后澄清无色为准），混匀，3500

转/分离心 10 分钟，小心取上清 1mL 作检测。

注 1：样本碱水解法的参考取样量：皮肤组织湿重 0.03～

0.05g，软骨湿重 0.08～0.1g，肝组织湿重 0.08～0.1g，

细胞培养液 0.5mL，血清（浆）0.5mL。

注 2：加水解液及调 pH 值甲液一定都要准确，否则较难调

PH 值。

注 3：样本称重时，一定要很精确，以免影响测定结果。先

将组织在保鲜薄膜上剪成湿重约 10mg 左右的块状后

再连同保鲜薄膜一起称重，称完后将样本放进试管中，

再将保鲜薄膜称重，计算出组织净重量。

注 4：如果您的样本量少，则可以从取样、水解、调 pH

均按比例减少，不影响结果。

注 5：每次混匀时可用塑料薄膜或冰箱保鲜膜压住试管口，

充分旋涡混匀，以免混匀过程中液体外溅。

注 6：95℃或者沸水浴时可以用带盖的玻璃磨口试管，也

可用普通玻璃试管代替，用保鲜薄膜封口扎紧，用

针头刺一小孔即可。我们建议用普通玻璃试管比带

盖的玻璃磨口试管更安全。

五、测定意义：

羟脯-氨酸在胶原蛋白中占 13.4%，在弹性蛋白中占极少

量，其它蛋白中均不存在。而胶原蛋白大多分布在皮肤、

腱、软骨、血管等处，因此羟脯-氨酸的量能反映结缔组织

疾病的胶原代谢情况。

有人把皮肤中羟脯-氨酸的测定作为筛选抗衰老药物的

一个指标。在发育阶段随年龄的增长，其羟脯-氨酸在尿中

排泄增加，而发育停止后稳定。老年人的羟脯-氨酸比年轻

人要少。

鼠患有自发性高血压及继发性高血压时，尿中羟脯-氨酸

含量增加。

手术创伤会导致尿羟脯-氨酸排泄量的增加，因高脂、低

蛋白、酒精中毒及毒物、营养不良，或肝细胞变性坏死，

通过炎症使纤维增加，分割肝小叶，导致肝硬化。肝纤维

化时，肝内主要增加的成分为胶原纤维，羟脯-氨酸为胶原

纤维所特-有，测定肝羟脯-氨酸的含量，可换算成肝胶原蛋

白的含量，以反映肝纤维化程度。胶原纤维分解主要依赖

胶原酶和其它蛋白酶的作用，其分解产物羟脯-氨酸从尿中

排出，测定尿羟脯-氨酸的含量，可反应胶原降解的情况。

通过测定组织及尿中羟脯-氨酸的含量，一方面可以判断纤

维化程度，同时可以筛选预防与治疗的药物。

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