磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性测定试剂盒
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磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性测定试剂盒,PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳生成草酰乙酸和磷酸氢离子,苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD +,在340nm测定NADH减少速率,从而计算PEPC活性。
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性测定试剂盒
( Phosphorescent Carboxylase,分光光度法 50T/48样)
一、测定原理
PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳生成草酰乙酸
和磷酸氢离子,苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH
生成苹果酸和NAD +,在340nm测定NADH减少速率,从而计
算PEPC活性。
二、自备仪器用品
台式离心机、紫外分光光度计、1mL石英比色皿、移液
枪、研钵、冰和蒸馏水
三、试剂组成和配制
提取液:60mL×1 瓶, 4℃保存
试剂一:30mL×1 瓶,4℃保存
试剂二:10mL×1 瓶,4℃保存
试剂三:粉剂×2支,-20℃保存,临用前加4mL蒸馏水充分
溶解,现用现配。
试剂四:粉剂×1 支,-20℃保存,临用前加5mL蒸馏水充分
溶解,用不完的分装后-20℃保存(禁止反复冻融)。
试剂五:原液20μL×1 支,4℃保存
试剂五:稀释液10mL×1 瓶,4℃保存
四、样品前处理
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心
后弃上清;按照细菌或细胞数量(10 4个):提取液体积
(mL)500-1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入
1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%
或200W,超声3s,间隔10 秒,重复30 次);在4°C下
8000g离心10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)1:5~10 的
比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液)进行冰
浴匀浆。8000g,4℃离心10min,取上清置冰上待测。
3、血清(浆)样品:直接检测
五、测定步骤
1. 分光光度计预热30min 以上,调节波长到340nm,用蒸
馏水调零。
2. 试剂五工作液的配置:将试剂五原液:试剂五稀释液
=1:329稀释,用多少配多少。
3. 将试剂一、二、三、四和试剂五工作液置于37°C(哺乳
动物)或25°C(其他物种)预热5分钟。
六、测定意义
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)广泛存在于动物、植物、
微生物和培养细胞中,是催化磷酸烯醇式丙酮酸与二氧化
碳反应生成草酰乙酸不可逆反应的酶,对三羧酸循环的运
转起重要调节作用。
七、PEPC活性计算
1 血清(浆)活力的计算
单位的定义:每mL 血清(浆)在每分钟消耗1nmol NADH
定义为一个酶活力单位。
PEPC(U/mL) = [△A×V反总÷(ε×d)×10 9 ]÷V样÷T
=1624×△A
2 组织、细菌或细胞中PFK活力计算
(1)按组织蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH
定义为一个酶活力单位。
PEPC(U/mg) = [△A×V反总÷(ε×d)×10 9 ]÷(Cpr×V)÷T
=1624×△A÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟消耗1nmol NADH定义为
一个酶活力单位。
PEPC(U/g) = [△A×V反总÷(ε×d)×10 9 ]÷(W×V 样÷V样总)÷T
=1624×△A÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol
NADH定义为一个酶活力单位。
PEPC(U/10 4 cells) = [△A×V反总÷(ε×d)×10 9 ]÷(500×V样÷V样总)÷T
=3.248×△A
ε:NADH在340nm 处摩尔吸光系数为6.22×10 3L/mol/cm;
d :比色皿光径(cm),1cm;
V反总:反应体系总体(L),1010μL=1.01×10 -3L;
10 9:1mol=1×10 9nmol;
Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL)
V样:加入反应体系中上清液体积(mL),20μL=0.02mL;
V样总:加入提取液体积,1mL
T:催化反应时间(min),5min。
W,样本质量,(g)。
500: 细菌或细胞总数,500万。
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性测定试剂盒