磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性测定试剂盒

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性测定试剂盒

（ Phosphorescent Carboxylase，分光光度法 50T/48样）

一、测定原理

PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳生成草酰乙酸

和磷酸氢离子，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH

生成苹果酸和NAD +，在340nm测定NADH减少速率，从而计

算PEPC活性。

二、自备仪器用品

台式离心机、紫外分光光度计、1mL石英比色皿、移液

枪、研钵、冰和蒸馏水

三、试剂组成和配制

提取液：60mL×1 瓶, 4℃保存

试剂一：30mL×1 瓶，4℃保存

试剂二：10mL×1 瓶，4℃保存

试剂三：粉剂×2支，-20℃保存，临用前加4mL蒸馏水充分

溶解，现用现配。

试剂四：粉剂×1 支，-20℃保存，临用前加5mL蒸馏水充分

溶解，用不完的分装后-20℃保存（禁止反复冻融）。

试剂五：原液20μL×1 支，4℃保存

试剂五：稀释液10mL×1 瓶，4℃保存

四、样品前处理

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心

后弃上清；按照细菌或细胞数量（10 4个）：提取液体积

（mL）500-1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入

1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％

或200W，超声3s，间隔10 秒，重复30 次）；在4°C下

8000g离心10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)1：5~10 的

比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰

浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测

五、测定步骤

1. 分光光度计预热30min 以上，调节波长到340nm，用蒸

馏水调零。

2. 试剂五工作液的配置：将试剂五原液：试剂五稀释液

=1:329稀释，用多少配多少。

3. 将试剂一、二、三、四和试剂五工作液置于37°C（哺乳

动物）或25°C（其他物种）预热5分钟。

六、测定意义

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）广泛存在于动物、植物、

微生物和培养细胞中，是催化磷酸烯醇式丙酮酸与二氧化

碳反应生成草酰乙酸不可逆反应的酶，对三羧酸循环的运

转起重要调节作用。

七、PEPC活性计算

1 血清（浆）活力的计算

单位的定义：每mL 血清（浆）在每分钟消耗1nmol NADH

定义为一个酶活力单位。

PEPC(U/mL) = [△A×V反总÷(ε×d)×10 9 ]÷V样÷T

=1624×△A

2 组织、细菌或细胞中PFK活力计算

（1）按组织蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH

定义为一个酶活力单位。

PEPC(U/mg) = [△A×V反总÷(ε×d)×10 9 ]÷(Cpr×V)÷T

=1624×△A÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol NADH定义为

一个酶活力单位。

PEPC(U/g) = [△A×V反总÷(ε×d)×10 9 ]÷(W×V 样÷V样总)÷T

=1624×△A÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol

NADH定义为一个酶活力单位。

PEPC(U/10 4 cells) = [△A×V反总÷(ε×d)×10 9 ]÷(500×V样÷V样总)÷T

=3.248×△A

ε：NADH在340nm 处摩尔吸光系数为6.22×10 3L/mol/cm；

d ：比色皿光径（cm），1cm；

V反总：反应体系总体（L），1010μL=1.01×10 -3L；

10 9：1mol=1×10 9nmol；

Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL）

V样：加入反应体系中上清液体积（mL），20μL=0.02mL；

V样总：加入提取液体积，1mL

T：催化反应时间（min），5min。

W，样本质量，（g）。

500： 细菌或细胞总数，500万。

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