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细胞核蛋白和胞浆蛋白制备试剂盒

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细胞核蛋白和胞浆蛋白制备试剂盒
本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取核蛋白或胞质蛋白,提取制备过程简便。制备的核蛋白和胞浆蛋白能保持天然活性,并且纯度较高。提取的蛋白特别适于转录因子活性分析、凝胶阻滞实验(gel shift assay, EMSA)、免疫共沉淀、酶活性测定,也适于 Western Blot 实验。

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细胞核蛋白和胞浆蛋白制备试剂盒

操作步骤:

1. 裂解(1) 培养细胞,PBS洗涤细胞两次,根据细胞计数,或者估计离心后的细胞体积PCV。每1 ×106个细胞加入50~100ul的CEB-A,刮下细胞转移至预冷的1.5ml离心管;或者每体积PCV细胞加入5倍PCV体积的CEB-A (即10~20 ml PCV的细胞加50~100ul的CEB-A),剧烈振荡重悬。

裂解: (2) 组织样本,精确称重后剪成小块,PBS洗涤。通常每10 mg动物组织相当于1×106个细胞,需加入50~100ulCEB-A,参照上表按比例加入。在冰上使用玻璃匀浆器匀浆组织,通常需要20~40次上下抽动匀浆,弃去筋膜组织。切记勿用高速电动匀浆器或超声破碎组织避免破坏细胞器结构。

2.  裂解产物转移至预冷的1.5ml离心管,剧烈振荡30秒,冰浴10~15min,期间每5分钟振荡15秒。

3. 可选步骤:根据步骤2裂解物体积,加入1/20体积的CEB-B,振荡10秒,冰浴1min (加入CEB-B可去除部分核膜蛋白,适于制备高纯度的核蛋白用于EMSA凝胶阻滞实验等,但可使胞浆蛋白出现很少量的膜蛋白污染。若制备高纯度胞浆蛋白可跳过此步骤。若制备核蛋白仅用于普通的Western Blot目的,则无须高纯度核蛋白,也可省略此步骤。

4.  胞浆蛋白组分的制备:将步骤2或步骤3的上清,12000g 4 oC离心5min,勿触动沉淀,将上清转移到新管,此即胞浆蛋白组分,可立即使用或−20~−70ºC保存。

5. 胞核粗提组分的制备:取第步骤4的原离心管,12000g 4 oC瞬时离心,尽量吸除上清,保留沉淀。加入100μl CEB-A和5μl  CEB-B,振荡10秒,重悬沉淀,冰浴1min,1000g 5min,弃上清。再次加入100μl CEB-A和5 μl CEB-B重悬沉淀冰浴1min,1000g 5min,尽弃上清,保留沉淀。

6.   胞核蛋白的制备:加50~100μl预冷NEB重悬步骤5的离心沉淀,剧烈振荡15秒,冰上30min,期间每10 min振荡15秒。12000g 5min,上清液含核蛋白成分,其中含有25%的甘油;可立即使用或−20~−70ºC保存。

 

细胞核蛋白和胞浆蛋白制备试剂盒

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